• facebook
  • linkedin
  • youtube

1. RNK eritmasining absorbsiyasini aniqlang

280, 320, 230 va 260 nm dagi yutilish mos ravishda nuklein kislota, fon (eritma loyqaligi), tuz konsentratsiyasi va oqsil kabi organik moddalar qiymatlarini ifodalaydi.Umuman olganda, faqat OD260/OD280 ga qarang (Ratio, R).1,8 ~ 2,0 bo'lsa, biz RNKdagi oqsil yoki boshqa organik moddalarning ifloslanishiga toqat qilish mumkin deb o'ylaymiz, ammo shuni ta'kidlash kerakki, Tris absorbansni aniqlash uchun bufer sifatida ishlatilganda, R qiymati 2 dan katta bo'lishi mumkin (umuman, u <2,2 bo'lishi kerak).R<1,8 bo'lsa, eritmadagi oqsil yoki boshqa organik moddalarning ifloslanishi aniqroq bo'lib, RNK taqdirini ehtiyojga qarab aniqlash mumkin.R>2,2 bo'lsa, bu RNKning bitta nuklein kislotaga gidrolizlanganligini bildiradi.
 
2.RNKning elektroforetik qolipi
Odatda, RNK elektroforezi uchun denaturatsiya qiluvchi gel ishlatiladi, lekin agar u faqat RNK sifatini aniqlash uchun bo'lsa, denaturatsiya jeli kerak emas va oddiy agaroz jelidan foydalanish mumkin.Elektroforezning maqsadi 28S va 18S tasmalarining yaxlitligini va ularning nisbatini yoki mRNK smearining yaxlitligini aniqlashdir.Odatda, agar 28S va 18S bantlari yorqin, aniq va o'tkir bo'lsa (tarmoqlarning chekkalari aniq bo'lsa) va 28S ning yorqinligi 18S bandidan ikki baravar ko'p bo'lsa, biz RNKning sifatini yaxshi deb hisoblaymiz.
Yuqoridagi biz tez-tez ishlatadigan ikkita usul, ammo bu ikki usulning hech biri RNK eritmasida qoldiq RNase mavjudligini aniq ayta olmaydi.Agar eritmada juda oz miqdorda RNase bo'lsa, uni yuqoridagi usul bilan aniqlash biz uchun qiyin, ammo keyingi fermentativ reaktsiyalarning aksariyati 37 darajadan yuqori va uzoq vaqt davomida amalga oshiriladi.Shu tariqa, agar RNK eritmasida juda oz miqdorda RNaz bo'lsa, u holda keyingi tajribalarda ularning rolini o'ynash uchun juda mos muhit va vaqt paydo bo'ladi va albatta bu vaqtda tajriba sovuq bo'ladi.Quyida biz RNK eritmasida qoldiq RNase mavjudligini tasdiqlaydigan usulni kiritamiz.
 
3. Issiqlikni saqlash sinovi
Namuna konsentratsiyasiga ko'ra, RNK eritmasidan ikkita 1000 ng RNK oling va uni 0,5 ml tsentrifuga trubasiga qo'shing va uni umumiy hajmi 10 ul bo'lgan pH 7,0 Tris buferi bilan to'ldiring, so'ngra naycha qopqog'ini yoping.Ulardan birini 70 ° C haroratda doimiy haroratli suv hammomiga qo'ying va uni 1 soat davomida issiq tuting.Boshqa qismi -20 ° C muzlatgichda 1 soat davomida saqlanadi.Vaqt tugagach, elektroforez uchun ikkita namunani olib tashlang.Elektroforez tugagandan so'ng, ikkalasining elektroforetik chiziqlarini solishtiring.Agar ikkalasining bandlari bir-biriga mos kelsa yoki sezilarli farqga ega bo'lmasa (albatta, ularning bandlari ham 2-usuldagi shartlarga javob beradi), demak, RNK eritmasida qoldiq RNase ifloslanishi yo'q va RNKning sifati juda yaxshi.Aksincha, agar 70 ° C da inkubatsiya qilingan namuna aniq degradatsiyani ko'rsatsa, bu RNK eritmasida RNaz bilan ifloslanish mavjudligini ko'rsatadi.
 
2 RNKni ajratib olishning eksperimental usullari va usullari
RNKni ajratib olishda biz tez-tez duch keladigan muammolar: (1) RNK chiqishi past;(2) RNK jiddiy tuz ifloslanishiga ega;(3) RNK jiddiy organik erituvchi ifloslanishiga ega;(4) namuna degradatsiyasi va boshqa muammolar
 
1. Keng tarqalgan ishlatiladigan umumiy RNK ekstraktsiya reagentlari
Guanidin izotiosiyanat usuli va Trizol usuli hayvonlar to'qimalari va hayvonlar hujayralaridan umumiy RNKni olish uchun eng ko'p qo'llaniladigan usullardir.Bu, ayniqsa, quyon terisidan va hayvonlarning biriktiruvchi to'qimalaridan umumiy RNKni olish kabi, ayniqsa, olish qiyin bo'lgan kichik namunalar va to'qimalar uchun mos keladi;Bundan tashqari, Trizol, umumiy maqsadli lizis reagenti sifatida, o'simlik to'qimalari, bakteriyalar, zamburug'lar va boshqa to'qimalarni olish uchun ham ishlatilishi mumkin.Kameliya oleifera, choy barglari, kolza va boshqalar kabi polisaxaridlar va polifenollarni o'z ichiga olgan o'simlik to'qimalari uchun CTAB usuli umumiy RNKni olish uchun ham ishlatilishi mumkin.

An'anaviy usul sifatida, ikki ustunli usul ham normal haroratda ishlashi, RNase qo'shishga hojat yo'qligi va xavfsizligi - ekstraktsiya uchun xloroform, fenollar va boshqa organik reagentlar yo'qligi tufayli juda mashhur.(tavsiya etilgan mahsulotlar )

1
2

2. Hayvon to'qimalaridan umumiy RNKni ajratib olish
 
(1) Agar u yangi bo'lmasa, yangi to'qimalarni tanlashga harakat qiling (afzal uch oy ichida - 80 ℃ muzlatgichda yoki suyuq azotda muzlatilgan. To'qimalarni kesishda xona haroratida to'g'ridan-to'g'ri kesmang, uni muz qutisiga qo'yishni unutmang, qayta-qayta muzlatish va eritishdan saqlanishga harakat qiling.
(2) To'qimalarning kichik qismini kesish uchun toza qaychi va cımbızdan foydalaning, namunani kesishda to'qimalarning markaziy qismini kesishga harakat qiling yoki birinchi navbatda o'rtadan katta to'qimalarni kesib oling va keyin namunani yangi kesma holatida kesib oling.Olib tashlangan to'qimalarni to'liq parchalash, maydalangan to'qimalarni RNazsiz EP trubasiga solib, lizat qo'shish, maydalangan to'qimalarni lizat bilan to'liq ta'sir qilish va gomogenizatsiyaga tayyorlash kerak.

(3) Oddiy to'qimalar uchun gomogenlash uchun mosh loviya o'lchamidagi to'qimalarni (30-60 mg) tanlang.Agar to'qimalarda ko'p miqdorda oqsil, yog' yoki jigar kabi zich tolali to'qimalar bo'lsa, kesilgan to'qimalarning miqdorini mos ravishda oshiring yoki kamaytiring (ixtiyoriy) 10 ~ 20 mg ni tanlang).
(4) Agar baliq muskullari, qisqichbaqalar go'shti, meduza va suv miqdori yuqori bo'lgan boshqa to'qimalar olinadigan bo'lsa, namuna hajmini mos ravishda oshirish kerak (100-200 mg tavsiya etiladi).
(5) Agar shartlar ruxsat etilsa, hayvon to'qimasini yuqori o'tishli to'qimalarni gomogenizatori bilan homogenlashtirgandan so'ng, agar bunday uskuna bo'lmasa, to'g'ridan-to'g'ri ekstraktsiya qilish mumkin.
(6) Yakuniy ekstraksiyadan keyin olingan RNK RNK parchalanishini kamaytirish uchun darhol muz qutisiga joylashtirilishi kerak.

3. Hayvon hujayralarining RNK ekstraktsiyasi

(1) Suspenziya hujayralari: to'g'ridan-to'g'ri santrifüj qiling va muhitni tashlang, steril PBS bilan 1-2 marta yuving, so'ngra tegishli miqdorda PBS bilan to'xtatib turing va keyin lizis uchun lizat qo'shing.Suyuqlikni to'liq tashlaganingizdan so'ng, lizatni to'g'ridan-to'g'ri cho'kma hujayralariga qo'shmang.Bu tashqi qatlamdagi lizislangan hujayralardan so'ng chiqarilgan giston paketining cho'kma hujayralarining tashqi tomoniga yopishishiga olib keladi va shu bilan pellet ichidagi hujayralarning lizat bilan aloqasini cheklaydi., natijada hujayra lizisining tugallanmaganligi va RNK hosildorligining pasayishi.

(2) Yarim yopishgan yoki mahkam yopishmaydigan hujayralar: Muhitni tashlaganingizdan so'ng, PBS bilan 1-2 marta yuving, so'ngra to'g'ridan-to'g'ri PBS ning tegishli miqdorini so'rib oling va hujayralarni puflash uchun madaniyat idishini pipetka yoki qurol bilan puflang va ularni RNKsiz hujayralarga o'tkazing.Ekstraksiya qilish uchun fermentning EP trubkasiga lizat qo'shing.

(3) yopishgan hujayralar: birinchi navbatda tripsin bilan hazm bo'lishi kerak, so'ngra RNazsiz EP naychalariga to'planishi kerak, supernatantni olib tashlash uchun santrifüj qilinadi, ortiqcha tripsinni olib tashlash uchun PBS bilan 1-2 marta yuviladi va tegishli miqdorda PBS bilan qayta suspenziya qilinadi Keyin ekstraksiya bosqichiga o'ting.

4. O‘simliklarning RNK ekstraktsiyasi

O'simlik to'qimalari fenolik birikmalarga boy yoki polisaxaridlarga boy yoki ba'zi noma'lum ikkilamchi metabolitlarni o'z ichiga oladi yoki RNazning yuqori faolligiga ega.Bu moddalar hujayra lizisidan so'ng RNK bilan mahkam bog'lanib, erimaydigan komplekslar yoki kolloid cho'kmalarni hosil qiladi, ularni olib tashlash qiyin.Shuning uchun, biz o'simlik to'qimasini chiqarganimizda, o'simliklar uchun to'plamni tanlashimiz kerak.To'plamdagi lizat polifenollarni oson oksidlanish va polisakkarid birikmalari va nuklein kislotalarni ajratish muammolarini samarali hal qilishi mumkin.

(Polisaxarid polifenol o'simlik RNK ekstraktsiyasi uchun tavsiya etilgan mahsulotlar:

(1) O'simlikning qobig'i, pulpasi, urug'lari, barglari va boshqalar ohakda to'liq maydalangan bo'lishi kerak.Silliqlash jarayonida namunani eritib yubormaslik uchun suyuq azotni o'z vaqtida to'ldirish kerak.Tuproq namunasi tezda lizatga qo'shilishi va RNK parchalanishiga yo'l qo'ymaslik uchun chayqalishi kerak.

(2) Guruch va bug'doy barglari kabi tolaga boy namunalar uchun ekstraktsiya miqdori mos ravishda kamaytirilishi kerak, aks holda to'qimalarni maydalash va lizis to'liq bo'lmaydi, natijada olingan RNKning past rentabelligi bo'ladi.

(3) Anor mevasi, tarvuz mevasi, shaftoli mevasi va boshqalar kabi suv miqdori yuqori bo'lgan o'simlik to'qimalari uchun namuna hajmi mos ravishda oshirilishi kerak (100-200 mg ixtiyoriy).

(4) O'simlik barglari, ildizpoyalari, qattiq mevalar va boshqa materiallar kabi o'simlik to'qimalariga, odatda, ohakdagi ingredientlarni yaxshilab ohak qilish uchun suyuq azotdan foydalanish tavsiya etiladi va keyin ekstraksiya bosqichiga o'ting.An'anaviy to'qima gomogenizatorlari o'simlik to'qimalarini homogenlashda samarali bo'lmasligi mumkin va odatda tavsiya etilmaydi.

5. RNK ekstraktsiyasi uchun ehtiyot choralari

(1) To'qimalarning namunalari qayta-qayta muzlatish va eritishning oldini olish uchun iloji boricha yangi bo'lishi kerak.

(2) Ekstraktsiya paytida to'qimalar to'liq maydalangan bo'lishi kerak va to'qimalarning miqdori juda oz bo'lmasligi kerak, juda ko'p.

(3) Namunani to'liq lizislash uchun lizat qo'shgandan keyin etarli inkubatsiya vaqti berilishi kerak.

(4) Ekstraksiya qilish uchun Trizol usulidan foydalanganda, qatlamlanishdan so'ng supernatantni so'rish printsipi "ko'proq nafas olishdan ko'ra kamroq nafas olishni afzal ko'radi" va o'rta qatlamga chiqarilmasligi kerak, aks holda bu jiddiy genomik DNK ifloslanishiga olib keladi.

(5) Yuvish paytida yuvish suyuqligi to'liq yuvishni ta'minlash uchun quvur devoriga to'liq infiltratsiya qilinishi kerak.

(6) Ustunni olish usuli uchun, yuvinishdan keyin ustunni ajratishdan tashqari, adsorbsion ustun ham ultra toza skameykaga joylashtirilishi va organik erituvchini quruqlikka to'liq bug'lanishi uchun 5-10 daqiqa davomida puflanishi kerak.

(7) Ustun usulining oxirgi elyusiyasida, DEPC suvini qo'shgandan so'ng, uni 3-5 daqiqa davomida inkubatsiya qilish kerak yoki DEPC suvini elutsiya hosildorligini oshirish uchun oldindan 60 ° C ga qizdirish kerak.An'anaviy Trizol parchalanishi va izopropanolni cho'ktirish usulida oxirgi RNK DEPC suvida eritiladi, shuning uchun eritish uchun tegishli vaqt berilishi kerak va santrifüj trubasining pastki qismi doimiy ravishda pipetka uchi bilan puflanishi kerak.

3 TRNKning past konsentratsiyasi / sifatsizligi sabablari va echimlari
 
1. Hosildorlik juda past
Chiqarilgan namuna juda past, umumiy miqdor etarli emas yoki olingan namuna juda ko'p va lizis tugallanmagan;ekstraksiya uchun tegishli sifatli to'qimalar yoki hujayralar ishlatilishi kerak, namunani oldindan davolash yaxshi bajarilishi kerak va lizis etarli bo'lishi kerak.
 
2. Genom qoldiqlari
Trizol usuli bilan ekstraksiya qilinganda, supernatant qatlamlangandan keyin o'rta qatlamga so'rilsa, genomning jiddiy ifloslanishi yuzaga keladi;o'rta qatlamga singib ketmaslik uchun qatlamlashda qo'shimcha ehtiyot bo'lish kerak.Agar ekstraksiya uchun ustun usuli ishlatilsa, ekstraksiya uchun DNase I o'z ichiga olgan to'plam tanlanishi mumkin.Membranada adsorbsiyalangan nuklein kislota to'g'ridan-to'g'ri DNase I bilan hazm qilinadi, bu DNK qoldiqlarini sezilarli darajada kamaytiradi.
 
3. RNK degradatsiyasi
Bu olingan namunaning o'zi yoki ekstraksiya jarayonida yuzaga kelgan degradatsiya bo'lishi mumkin;iloji boricha RNK ekstraktsiyasi uchun yangi namunalardan foydalanish kerak va to'plangan namunalar suyuq azotda yoki -80 ° C muzlatgichda o'z vaqtida saqlanishi va takroriy muzlatish va eritishdan qochish kerak.RNK ekstraktsiya jarayonida RNase/DNase bo'lmagan uchlari, sentrifuga naychalari va boshqa materiallardan foydalanish kerak.Ekstraksiya jarayoni imkon qadar tez bo'lishi kerak.Chiqarilgan RNK muzli qutiga joylashtirilishi va vaqtida -80 da saqlanishi kerak.Agar ekstraksiya qilingan RNKni gel elektroforez bilan aniqlash kerak bo'lsa, ekstraksiyadan so'ng darhol elektroforez o'tkazilishi kerak va elektroforez buferi yangi tayyorlangan bilan almashtirilishi kerak.
 
4. Tuz va organik erituvchi qoldiqlari
Ekstraksiya reagentlarida fenol va guanidin tuzlari, yuvish eritmasida esa etanol mavjud.Ekstraksiya jarayonida lizat to'liq so'rilmagan va tashlanmagan va yuvish eritmasi to'liq quritilmagan.Qoldiq tuzlar va organik erituvchilar keyingi teskari transkripsiya va PCR uchun zararli.Turli darajadagi inhibisyonlar, shuning uchun ekstraksiya jarayonida to'qima lizatini to'liq olib tashlash kerak va yuvish etarli bo'lishi kerak, shunda trubaning atrofdagi devorlari yuvilishi mumkin.Bundan tashqari, kolba bo'shatiladi va puflanadi zarur qadam , bu organik moddalarning qoldiqlarini yanada kamaytiradi.
 
RNK ekstraktsiyasi haqida ko'proq ma'lumot olish uchun bizning veb-saytimizga tashrif buyuring:
Qo'shimcha ma'lumot uchun www.foreivd.com.

7

Yuborilgan vaqt: 01-dekabr 2022-yil