Boshlang'ich material: RNK
Kantitativ teskari transkripsiyali PCR (RT-qPCR) boshlang'ich material sifatida RNKdan foydalangan holda PCR tajribalarida qo'llaniladigan eksperimental usuldir.Bu usulda jami RNK yoki xabarchi RNK (mRNK) birinchi navbatda teskari transkriptaza yordamida komplementar DNKga (cDNK) transkripsiyalanadi.Keyinchalik, shablon sifatida cDNK yordamida qPCR reaktsiyasi amalga oshirildi.RT-qPCR turli xil molekulyar biologiya dasturlarida, jumladan gen ekspressiyasini tahlil qilish, RNK aralashuvini tekshirish, mikroarray tekshiruvi, patogenni aniqlash, genetik test va kasalliklarni o'rganishda qo'llanilgan.
RT-qPCR uchun bir bosqichli va ikki bosqichli usullar
RT-qPCR bir bosqichli yoki ikki bosqichli usul bilan amalga oshirilishi mumkin.Bir bosqichli RT-qPCR teskari transkripsiya va PCR kuchaytirilishini birlashtirib, teskari transkriptaza va DNK polimeraza bir xil tampon sharoitida bir xil naychadagi reaktsiyani yakunlash imkonini beradi.Bir bosqichli RT-qPCR faqat ketma-ketlikka xos primerlardan foydalanishni talab qiladi.Ikki bosqichli RT-qPCRda teskari transkripsiya va PCR kuchaytirilishi turli xil optimallashtirilgan buferlar, reaktsiya sharoitlari va primer dizayn strategiyalaridan foydalangan holda ikkita naychada amalga oshiriladi.
Afzallik | Kamchilik | |
Bir qadam | Bu usulda eksperimental xatolik kamroq bo'ladi, chunki ikkala reaksiya ham bitta naychada amalga oshiriladi
Kamroq pipetlash bosqichlari ifloslanish xavfini kamaytiradi
Yuqori quvvatli kuchaytirish/skrining uchun javob beradi, tez va takrorlanadi | Ikki bosqichli reaktsiyalarni alohida optimallashtirish mumkin emas
Ikki bosqichli reaktsiyani birlashtirish natijasida reaktsiya sharoitlari buzilganligi sababli, sezgirlik ikki bosqichli usuldagi kabi yaxshi emas.
Bitta namunada aniqlangan nishonlar soni kam |
Ikki qadam | Uzoq vaqt davomida saqlanishi va bir nechta reaktsiyalarda ishlatilishi mumkin bo'lgan barqaror cDNK kutubxonalarini yaratish qobiliyati
Maqsadli genlar va mos yozuvlar genlari bir xil cDNK kutubxonasidan bir nechta cDNK kutubxonalariga ehtiyoj sezmasdan kuchaytirilishi mumkin.
Yagona reaksiya jarayonlarini optimallashtirish imkonini beruvchi reaksiya buferlari va reaksiya sharoitlari
Trigger shartlarini moslashuvchan tanlash | Bir nechta naychalardan foydalanish va ko'proq pipetlash bosqichlari DNK bilan ifloslanish xavfini oshiradi, va vaqt talab qiladi.
Bir bosqichli usuldan ko'ra ko'proq optimallashtirishni talab qiladi |
Tegishli mahsulotlar:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Bir qadam)-SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Bir qadam)-Taqman
RT Easyᵀᴹ Birinchi strandli CDNA sintezi uchun asosiy premiks
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I to'plami
Umumiy RNK va mRNKni tanlash
RT-qPCR tajribasini loyihalashda teskari transkripsiya uchun shablon sifatida umumiy RNK yoki tozalangan mRNK dan foydalanishni hal qilish muhimdir.mRNK biroz yuqori sezuvchanlikni ta'minlashi mumkin bo'lsa-da, umumiy RNK hali ham tez-tez ishlatiladi.Buning sababi shundaki, umumiy RNK mRNKga qaraganda boshlang'ich material sifatida muhimroq afzalliklarga ega.Birinchidan, jarayon kamroq tozalash bosqichlarini talab qiladi, bu shablonni yaxshi miqdoriy qayta tiklashni va natijalarni boshlang'ich hujayra raqamlariga yaxshiroq normallashtirishni ta'minlaydi.Ikkinchidan, u mRNKni boyitish bosqichidan qochadi, bu esa turli mRNKlarning turli xil qayta tiklanishi tufayli egri natijalar ehtimolini oldini oladi.Umuman olganda, ko'pgina ilovalarda maqsadli genning nisbiy miqdori aniqlashning mutlaq sezgirligidan muhimroq bo'lganligi sababli, umumiy RNK ko'p hollarda ko'proq mos keladi.
Teskari transkripsiya primeri
Ikki bosqichli usulda cDNK reaksiyasini tayyorlash uchun uch xil usuldan foydalanish mumkin: oligo(dT) primerlari, tasodifiy primerlar yoki ketma-ketlikka xos primerlar.Odatda, oligo (dT) primerlari va tasodifiy primerlar birgalikda qo'llaniladi.Ushbu primerlar shablon mRNK zanjiriga yopishadi va sintez uchun boshlang'ich nuqtasi bilan teskari transkriptaza beradi.
Primer tanlash | Tuzilishi va funktsiyasi | Afzallik | Kamchilik |
Oligo(dT) astar (yoki ankrajli oligo(dT) astar) | mRNKning poli(A) dumidagi timin qoldiqlariga kengaytirilgan tavlanish;anchor oligo(dT) primeri 3′ uchida G, C yoki A ni o'z ichiga oladi (langar joyi) | Poli (A) dumli mRNK dan to'liq uzunlikdagi cDNK sintezi
Kamroq boshlang'ich material mavjud bo'lganda qo'llaniladi
Ankraj joyi oligo (dT) primerining mRNKning 5' poli(A) dumiga bog'lanishini ta'minlaydi. | Faqat poli (A) quyruqli genlarni kuchaytirish uchun javob beradi
Poli(A) da astarlash joyidan*2 kesilgan cDNKni oling
3' uchiga bog'lash uchun mo'ljallangan *
*Agar ankrajlangan oligo(dT) primerlari ishlatilsa, bu imkoniyat minimallashtiriladi |
tasodifiy primer
| Uzunligi 6 dan 9 gacha bo'lgan asoslar, ular RNK transkripsiyasi paytida bir nechta joylarga qo'shila oladi | Barcha RNK larga (tRNK, rRNK va mRNK) yopishadi
Muhim ikkilamchi tuzilishga ega bo'lgan yoki boshlang'ich material kamroq bo'lsa, transkriptlar uchun javob beradi
Yuqori cDNK rentabelligi | cDNK barcha RNKlardan teskari transkripsiya qilinadi, bu odatda istalmagan va maqsadli mRNK signalini suyultirishi mumkin.
kesilgan cDNKni oling |
ketma-ketlikka xos primerlar | Muayyan mRNK ketma-ketligini maqsad qilgan maxsus primerlar | maxsus cDNK kutubxonasi
Sezuvchanlikni yaxshilang
Teskari qPCR primerlaridan foydalanish | Faqat bitta maqsadli genning sintezi bilan cheklangan |
Teskari transkriptaza
Teskari transkriptaza - bu DNKni sintez qilish uchun RNKdan foydalanadigan ferment.Ba'zi teskari transkriptazalar RNaz faolligiga ega va transkripsiyadan keyin RNK-DNK gibrid zanjirlarida RNK zanjirlarini buzishi mumkin.Agar u RNase enzimatik faolligiga ega bo'lmasa, qPCR samaradorligini oshirish uchun RNaseH qo'shilishi mumkin.Odatda ishlatiladigan fermentlarga Moloney sichqon leykemiya virusi teskari transkriptazasi va parranda miyeloblastoma virusi teskari transkriptaza kiradi.RT-qPCR uchun termostabilligi yuqori bo'lgan teskari transkriptazani tanlash ideal bo'lib, cDNK sintezi yuqori haroratlarda amalga oshirilishi, yuqori ikkilamchi tuzilishga ega bo'lgan RNKlarning muvaffaqiyatli transkripsiyasini ta'minlaydi, shu bilan birga butun reaksiya davomida ularning to'liq faolligini saqlab qoladi, natijada cDNK hosildorligi yuqori bo'ladi.
Tegishli mahsulotlar:
Oldindan M-MLV teskari transkriptaza
Teskari transkriptazaning RNase H faolligi
RNaseH RNK-DNK duplekslaridan RNK zanjirlarini parchalashga qodir, bu ikki zanjirli DNKning samarali sintezini ta'minlaydi.Biroq, uzun mRNKni shablon sifatida ishlatganda, RNK muddatidan oldin parchalanishi mumkin, natijada cDNK kesiladi.Shuning uchun, agar uzoq transkriptlarni sintez qilish zarur bo'lsa, cDNK klonlash paytida RNaseH faolligini minimallashtirish foydali bo'ladi.Bundan farqli o'laroq, RNase H faolligi bilan teskari transkriptazalar ko'pincha qPCR ilovalari uchun foydalidir, chunki ular PCRning birinchi siklida RNK-DNK duplekslarining erishini kuchaytiradi.
Primer dizayni
RT-qPCR da qPCR bosqichi uchun ishlatiladigan PCR primerlari ideal tarzda ekson-ekson birikmasini qamrab olish uchun mo'ljallangan bo'lishi kerak, bu erda kuchaytiruvchi primer haqiqiy ekson-intron chegarasini qamrab olishi mumkin.Intron o'z ichiga olgan genomik DNK ketma-ketliklari kuchaytirilmaganligi sababli, bu dizayn genomik DNKni ifloslantirishdan kuchaytirilgan noto'g'ri musbatlar xavfini kamaytiradi.
Agar primerlar ekzonlar yoki ekson-ekson chegaralarini ajratish uchun mo'ljallangan bo'lmasa, genomik DNK ifloslanishini olib tashlash uchun RNK namunalarini RNazsiz DNase I yoki dsDNase bilan davolash kerak bo'lishi mumkin.
RT-qPCR nazorati
Teskari transkripsiya salbiy nazorati (-RT nazorati) DNK ifloslanishini aniqlash uchun barcha RT-qPCR tajribalariga kiritilishi kerak (masalan, genomik DNK yoki oldingi reaktsiyalardagi PCR mahsulotlari).Ushbu nazorat teskari transkriptazadan tashqari barcha reaktsiya komponentlarini o'z ichiga oladi.Ushbu nazorat bilan teskari transkripsiya sodir bo'lmagani uchun, agar PCR kuchaytirilishi kuzatilsa, DNK dan ifloslanish ehtimoli katta.
Yuborilgan vaqt: 2022-yil 2-avgust