Ⅰ. Reaksiya tizimining sezgirligini oshiring:
1. Yuqori sifatli RNKni ajratib oling:
Muvaffaqiyatli cDNK sintezi yuqori sifatli RNKdan kelib chiqadi.Yuqori sifatli RNK kamida umumiy uzoqroq bo'lishini ta'minlashi kerak va EDTA yoki SDS kabi qayd qiluvchi fermentlarni o'z ichiga olmaydigan inhibitorlarni o'z ichiga olmaydi.RNK sifati cDNKga transkripsiya qilishingiz mumkin bo'lgan ketma-ketlik ma'lumotlarining maksimal qiymatini belgilaydi.Umumiy RNKni tozalash usuli izoosiyanat/asidofenoldan foydalanishning bosqichli usuli hisoblanadi.RNazning ifloslanishini oldini olish uchun RNazga boy namunadan (masalan, oshqozon osti bezi) ajratilgan RNK yuqori sifatli RNKni saqlash uchun formaldegidni saqlashni talab qiladi, bu esa uzoq muddatli saqlash uchun undan ham ko'proq.Sichqon jigaridan olingan RNK suvda bir hafta saqlanganidan so'ng asosan degradatsiyaga uchradi, kalamush taloqidan olingan RNK esa uch yil suvda saqlanganidan keyin barqaror bo'lib qoldi.Bundan tashqari, 4 kb dan katta transkriptlar kichik transkriptlarga qaraganda RNase degradatsiyasini kuzatishga sezgir.Saqlash RNK namunasining barqarorligini oshirish uchun RNK ionning metalmaminida eritilishi mumkin va -70 ° C da saqlanadi.RNKni saqlash uchun ishlatiladigan tilid tarkibida RNKni buzuvchi har xil ob'ekt bo'lmasligi kerak.Oshqozon osti bezidan olingan RNK kamida bir yil davomida metalmaminda saqlanishi mumkin.RNK dan foydalanishga tayyor bo'lgach, RNKni cho'ktirish uchun quyidagi usullardan foydalanishingiz mumkin: NaCl ni 0,2 m va 4 marta hajmdagi etanolga qo'shing, xona haroratini 3-5 minutga qo'ying va 10 000 × g markazdan qochqinni 5 daqiqaga qo'ying.
2. RNaseH faolligisiz teskari transkriptazadan foydalaning (RNaseH-):
RNaz inhibitörleri ko'pincha cDNK sintezining uzunligi va rentabelligini oshirish uchun teskari transkripsiya reaktsiyalariga qo'shiladi.RNase ingibitori birinchi zanjirli sintez reaktsiyasida DTT kabi tamponlar va qaytaruvchi moddalar ishtirokida qo'shiladi, chunki pre-cDNK sintez jarayoni inhibitorni denatüratsiya qiladi va shu bilan RNKni buzuvchi bog'langan RNazalarni chiqaradi.Protein RNase inhibitori faqat RNKning A, B, C RNase tomonidan degradatsiyasini oldini oladi va teriga RNazlarning oldini olmaydi, shuning uchun bu inhibitorlardan foydalanishga qaramay, RNazlarni barmoqlardan kiritmaslik uchun ehtiyot bo'lish kerak.
Teskari transkriptaza RNKning cDNK ga aylanishini katalizlaydi.M-MLV ham, AMV ham o'zlarining polimeraza faolligiga qo'shimcha ravishda endogen RNaseH faolligiga ega.RNaseH faolligi RNK shablonlari va DNK primerlari yoki cDNK kengaytmalari o'rtasida hosil bo'lgan heterozigot zanjirlar uchun polimeraza faolligi bilan raqobatlashadi va RNKni: DNK komplekslarida RNK zanjirlarini buzadi.RNaseH faolligi bilan buzilgan RNK shablonlari endi cDNK sintezi uchun samarali substrat sifatida qo'llanilmaydi, bu esa cDNK sintezining rentabelligini va uzunligini kamaytiradi.Shunday qilib, teskari transkriptazaning RNaseH faolligini yo'q qilish yoki sezilarli darajada kamaytirish katta foyda keltiradi.
SuperScriptⅡ teskari transkriptaza, RNaseH-ning MMLV teskari transkriptazasi va termoScript teskari transkriptaza, RNaseH-ning AMV-si MMLV va AMVga qaraganda ko'proq to'liq uzunlikdagi cDNKni berdi.RT-PCR sezgirligiga sintez qilingan cDNK miqdori ta'sir qiladi.ThermoScript AMVga qaraganda ancha sezgir.RT-PCR mahsulotlarining hajmi teskari transkriptazaning cDNKni sintez qilish qobiliyati bilan cheklangan, ayniqsa kattaroq Cdnalarni klonlashda.MMLV bilan solishtirganda, SuperScripⅡ uzoq RT-PCR mahsulotlarining hosildorligini sezilarli darajada oshirdi.RNaseH- ning teskari transkriptazasi ham termal barqarorlikni oshiradi, shuning uchun reaktsiya 37-42 ℃ dan yuqori haroratlarda amalga oshirilishi mumkin.Tavsiya etilgan sintez sharoitida oligo(dT) primerlari va 10mCi [alfa-p]dCTP ishlatilgan.Birinchi zanjirning umumiy ishlab chiqarishi TCA yog'ingarchilik usuli yordamida hisoblab chiqilgan.To'liq uzunlikdagi cDNK o'lchami bo'yicha saralangan chiziqni olib tashlash va gidroksidi agaroz jelida hisoblash yordamida tahlil qilindi.
3. Teskari transkripsiyaning issiqlikni saqlash haroratini oshiring:
Yuqori ushlab turish harorati RNKning ikkilamchi strukturasini ochishga yordam beradi va reaksiya hosildorligini oshiradi.Aksariyat RNK shablonlari uchun RNK va primerni tampon yoki tuzsiz 65°C haroratda ushlab turish va keyin ularni muzda tez sovutish ko'pgina ikkilamchi tuzilmalarni yo'q qiladi va primerlarni bog'lash imkonini beradi.Biroq, ba'zi shablonlar termal denatürasyondan keyin ham ikkinchi darajali tuzilishga ega.Ushbu qiyin shablonlarni kuchaytirish ThermoScript teskari transkriptaza yordamida va kuchaytirishni yaxshilash uchun teskari transkriptaza reaktsiyasini yuqori haroratlarda joylashtirish orqali amalga oshirilishi mumkin.Yuqori ushlab turish harorati ham o'ziga xoslikni oshirishi mumkin, ayniqsa cDNK sintezi genga xos primerlar (GSPS) yordamida amalga oshirilganda (3-bobga qarang).Agar GSP dan foydalansangiz, primerning Tm qiymati kutilgan ushlab turish harorati bilan bir xil ekanligiga ishonch hosil qiling.60℃ dan yuqori oligo(dT) va tasodifiy primerlardan foydalanmang.Tasodifiy primerlarni 60 ℃ ga oshirishdan oldin 10 daqiqa davomida 25 ℃ haroratda ushlab turish kerak.Yuqori teskari transkripsiya haroratidan foydalanishga qo'shimcha ravishda, o'ziga xoslikni RNK/primer aralashmasini 65 ℃ denaturatsiya haroratidan teskari transkripsiyani ushlab turish haroratiga to'g'ridan-to'g'ri o'tkazish va oldindan qizdirilgan 2 × reaktsiya aralashmasini (cDNK termal boshlash sintezi) qo'shish orqali yaxshilash mumkin.Ushbu yondashuv past haroratlarda yuzaga keladigan molekulalararo asos juftligini oldini olishga yordam beradi.PCR asbobidan foydalanish RT-PCR uchun zarur bo'lgan ko'plab harorat kalitlarini soddalashtiradi.
Tth issiqlik stabillashgan polimeraza Mg2+ ishtirokida DNK polimeraza va Mn2+ ishtirokida RNK polimeraza vazifasini bajaradi.U 65 ℃ gacha issiqlikni ushlab turishi mumkin.Biroq, PCR paytida Mn2+ mavjudligi aniqlikni pasaytiradi, bu Tth polimerazni cDNK klonlash kabi yuqori aniqlikdagi kuchaytirish uchun kamroq mos keladi.Bundan tashqari, Tth teskari transkripsiyada kamroq samarali bo'lib, bu sezgirlikni pasaytiradi va bitta ferment teskari transkripsiya va PCRni amalga oshirishi mumkinligi sababli, cDNKning kuchaytirilgan mahsulotlarini ifloslangan genomik DNKdan ajratish uchun teskari transkripsiyasiz nazorat reaktsiyalaridan foydalanish mumkin emas.
4. Teskari transkripsiyaga yordam beruvchi qo'shimcha:
Birinchi zanjirli sintez reaktsiyasiga qo'shimchalar, shu jumladan glitserin va DMSO qo'shilishi nuklein kislotaning qo'sh zanjirining barqarorligini kamaytirishi va RNKning ikkilamchi tuzilishini ochishi mumkin.SuperScriptⅡ yoki MMLV faolligiga ta'sir qilmasdan 20% gacha glitserin yoki 10% DMSO qo'shilishi mumkin.AMV shuningdek, faollikni kamaytirmasdan 20% gacha glitseringa bardosh bera oladi.SuperScriptⅡ teskari transkripsiya reaktsiyasida RT-PCR sezgirligini maksimal darajada oshirish uchun 10% glitserin qo'shilishi va 45 ℃ da izolyatsiya qilinishi mumkin.Agar retrotranskripsiya-reaktsiya mahsulotining 1/10 qismi PCRga qo'shilsa, kuchaytirish reaktsiyasida glitserin konsentratsiyasi 0,4% ni tashkil qiladi, bu PCRni inhibe qilish uchun etarli emas.
5. RNaseH ni qayta ishlash:
PCRdan oldin cDNK sintezi reaktsiyalarini RNaseH bilan davolash orqali sezgirlikni yaxshilash mumkin.Ba'zi shablonlar uchun cDNK sintez reaktsiyasidagi RNK kuchaytirilgan mahsulotlarning bog'lanishiga to'sqinlik qiladi, deb hisoblashadi, bu holda RNaseH bilan davolash sezgirlikni oshirishi mumkin.Umuman olganda, RNaseH bilan davolash nisbatan uzun to'liq uzunlikdagi cDNK maqsadli shablonini, masalan, tuberous skeroziⅡ kam nusxasini kuchaytirish uchun talab qilinadi.Ushbu qiyin shablon uchun RNaseH SuperScriptⅡ yoki AMV tomonidan sintez qilingan cDNK tomonidan yaratilgan signalni kuchaytirdi.Ko'pgina RT-PCR reaktsiyalari uchun RNaseH bilan davolash ixtiyoriydir, chunki 95 ℃ izolyatsiyalangan PCR denatürasyon bosqichi odatda RNK: DNK kompleksidan RNKni gidrolizlaydi.
6. Kichik miqdordagi RNKni aniqlashning takomillashtirilgan usullari:
RNKning kichik miqdori mavjud bo'lganda RT-PCR ayniqsa qiyin.RNKni ajratish jarayonida tashuvchi sifatida glikogen qo'shilishi kichik namunalar hosilini oshirishga yordam beradi.Trizol bilan bir vaqtda RNazsiz glikogen qo'shilishi mumkin.Glikogen suvda eriydi va keyingi yog'ingarchiliklarga yordam berish uchun RNK bilan suv fazasida qolishi mumkin.RNazsiz glikogenning tavsiya etilgan kontsentratsiyasi 50 mg to'qima yoki 106 kulturali hujayradan kam namunalar uchun 250 mkg/ml ni tashkil qiladi.
SuperScriptⅡ yordamida teskari transkripsiya reaktsiyalariga atsetillangan BSA qo'shilishi sezgirlikni oshirishi mumkin va kichik miqdordagi RNK uchun SuperScriptⅡ miqdorini kamaytirish va 40 birlik RnaseOut nukleaza inhibitori qo'shish aniqlash darajasini oshirishi mumkin.Agar RNKni ajratishda glikogen ishlatilsa, SuperScriptⅡ yordamida teskari transkripsiya reaktsiyalari uchun BSA yoki RNase inhibitörlerini qo'shish tavsiya etiladi.
Ⅱ. RT-PCR ning o'ziga xosligini oshirish
1. cNDA sintezi:
Birinchi zanjirli cDNK sintezini boshlash uchun uch xil usuldan foydalanish mumkin va har bir usulning nisbiy o'ziga xosligi sintez qilingan cDNK miqdori va turiga ta'sir qiladi.
Tasodifiy primer usuli uchta usuldan eng kam o'ziga xosdir.Primerlar qisqa, qisman uzunlikdagi cDNK hosil qilish uchun transkript davomida bir nechta joylarda tavlanadi.Bu usul ko'pincha ikkilamchi strukturaviy hududlarga ega yoki teskari transkriptaza replikatsiya qila olmaydigan tugatish joylariga ega RNK shablonlaridan 5' terminal ketma-ketligi va cDNKni olish uchun ishlatiladi.Eng uzun cDNKni olish uchun har bir RNK namunasidagi primerlarning RNKga nisbati empirik tarzda aniqlanishi kerak.Tasodifiy primerlarning dastlabki kontsentratsiyasi 20 mkl reaktsiya tizimi uchun 50 dan 250 ng gacha.Tasodifiy primerlar yordamida jami RNKdan sintez qilingan cDNK asosan ribosoma RNK bo'lgani uchun, odatda, shablon sifatida poli(A)+RNK tanlanadi.
Oligo (dT) boshlanishi tasodifiy primerlarga qaraganda o'ziga xosdir.U ko'pchilik eukaryotik hujayralardagi mRNKning 3' uchida joylashgan poli(A) dumi bilan gibridlanadi.Poli (A) + RNK umumiy RNKning taxminan 1% dan 2% gacha bo'lganligi sababli, cDNK miqdori va murakkabligi tasodifiy primerlar ishlatilganidan ancha past bo'ladi.Oligo (dT) o'zining yuqori o'ziga xosligi tufayli, odatda, RNK-primer nisbati va poli(A)+ tanlash uchun optimallashtirishni talab qilmaydi.20 mkl reaktsiya tizimi uchun 0,5 mkg oligo (dT) dan foydalanish tavsiya etiladi.oligo(dT)12-18 ko'pchilik RT-PCR uchun javob beradi.ThermoScript RT-PCR tizimi yaxshi termal barqarorligi tufayli oligo(dT)20 ni ta'minlaydi va yuqori ushlab turish haroratiga mos keladi.
Genga xos primerlar (GSP) teskari transkripsiya bosqichi uchun eng yaxshi maxsus primerlardir.GSP - bu tasodifiy primerlar yoki oligo (dT) kabi barcha Rnalarni tavlashdan ko'ra, RNK maqsadli ketma-ketliklari bilan maxsus gibridlanishi mumkin bo'lgan antisens oligonukleoziddir.PCR primerlarini loyihalashda qo'llaniladigan qoidalar teskari transkripsiya reaktsiyasi GSP dizayniga ham tegishli.GSP mRNA3' oxirida tavlanadigan kuchaytiruvchi primer bilan bir xil ketma-ketlikda bo'lishi mumkin yoki GSP teskari kuchaytiruvchi primer bilan quyi oqimda tavlanish uchun mo'ljallangan bo'lishi mumkin.Ba'zi kuchaytirilgan ob'ektlar uchun muvaffaqiyatli RT-PCR uchun bir nechta antisensli primerlarni loyihalash kerak, chunki maqsadli RNKning ikkilamchi tuzilishi primerning bog'lanishiga to'sqinlik qilishi mumkin.20 mkl birinchi zanjirli sintez reaktsiyasi tizimida 1pmol antisens GSP dan foydalanish tavsiya etiladi.
2. Teskari transkripsiyaning issiqlikni saqlash haroratini oshiring:
GSP o'ziga xosligidan to'liq foydalanish uchun yuqori termal barqarorlikka ega teskari transkriptazadan foydalanish kerak.Issiqlikka chidamli teskari transkriptaza reaktsiyaning qattiqligini oshirish uchun yuqori haroratlarda izolyatsiya qilinishi mumkin.Misol uchun, agar GSP 55 ° C da tavlansa, AMV yoki M-MLV yordamida teskari transkripsiya 37 ° C da past qat'iylik bilan amalga oshirilsa, GSP ning o'ziga xosligi to'liq foydalanilmaydi.Biroq, SuperScripⅡ va ThermoScript 50℃ yoki undan yuqori haroratda reaksiyaga kirishishi mumkin, bu esa past haroratlarda ishlab chiqariladigan o'ziga xos bo'lmagan mahsulotlarni yo'q qiladi.Maksimal o'ziga xoslik uchun RNK/primer aralashmasi oldindan qizdirilgan 2 x reaksiya aralashmasi (cDNK sintezining termal boshlanishi) qo'shilishi bilan to'g'ridan-to'g'ri 65 ℃ denaturatsiya haroratidan teskari transkripsiyani ushlab turish haroratiga o'tkazilishi mumkin.Bu past haroratlarda molekulalar orasidagi tayanch juftligini oldini olishga yordam beradi.PCR asbobidan foydalanish RT-PCR uchun zarur bo'lgan ko'plab harorat o'tishlarini soddalashtiradi.
3. Genomik DNK ifloslanishini kamaytirish:
RT-PCR bilan bog'liq potentsial qiyinchiliklardan biri RNKning genomik DNKni ifloslanishidir.Trizol reagenti kabi yaxshiroq RNK ajratish usullaridan foydalanish RNK preparatlarida genomik DNK ifloslanishini kamaytiradi.Genomik DNKdan ishlab chiqarilgan mahsulotlardan qochish uchun RNKni teskari transkripsiyadan oldin ifloslangan DNKni olib tashlash uchun DNAsⅠ kuchaytiruvchi daraja bilan davolash mumkin.Namunalar DNaseⅠ hazm qilishni tugatish uchun 10 daqiqa davomida 2,0 mM EDTA da 65 ℃ haroratda saqlangan.EDTA yuqori haroratlarda yuzaga keladigan magniy ioniga bog'liq RNK gidrolizini oldini olish uchun magniy ionlarini xelatlaydi.
Amplifikatsiya qilingan cDNKni genom DNK kuchaytiruvchi mahsulotidan ajratish uchun ajratilgan ekson bilan alohida tavlanadigan primerlar ishlab chiqilishi mumkin.cDNK dan olingan PCR mahsulotlari ifloslangan genomik DNK dan olingan mahsulotlarga qaraganda qisqaroq bo'ladi.Berilgan fragment genomik DNK yoki cDNK dan ekanligini aniqlash uchun har bir RNK shablonida teskari transkripsiyasiz boshqariladigan tajriba ham o'tkaziladi.Teskari transkripsiya bo'lmaganda olingan PCR mahsulotlari genomdan olinadi.
Tegishli mahsulot
-Bir bosqichli to'plam teskari transkripsiya va PCRni bir xil naychada o'tkazish imkonini beradi.Unga faqat shablon RNK, maxsus PCR primerlari va RNase-Free ddH qo'shish kerak2O.
-RNKning real vaqt rejimida miqdoriy tahlili tez va aniq amalga oshirilishi mumkin.
-To'plamda noyob Foregene teskari transkripsiya reagenti va Foregene HotStar Taq DNK Polimerazasi noyob reaktsiya tizimi bilan birgalikda kuchaytirilish samaradorligi va reaktsiyaning o'ziga xosligini samarali yaxshilash uchun foydalanadi.
- Optimallashtirilgan reaktsiya tizimi reaktsiyani yuqori sezuvchanlik, kuchli termal barqarorlik va yaxshi bardoshlik bilan ta'minlaydi.
- 2 daqiqa ichida shablondagi gDNKni olib tashlashi mumkin bo'lgan gDNKni olib tashlashning samarali qobiliyati.
- Samarali teskari transkripsiya tizimi, cDNKning birinchi zanjiri sintezini yakunlash uchun atigi 15 daqiqa vaqt ketadi.
-Murakkab shablonlar: yuqori GC tarkibiga va murakkab ikkilamchi tuzilishga ega shablonlarni ham yuqori samaradorlik bilan qaytarish mumkin.
-Yuqori sezgir teskari transkripsiya tizimi, pg-darajali shablonlar ham yuqori sifatli cDNKni olishi mumkin.
- Teskari transkripsiya tizimi yuqori termal barqarorlikka ega, optimal reaktsiya harorati 42 ℃ va u hali ham 50 ℃ da yaxshi teskari transkripsiyaga ega.
Yuborilgan vaqt: 2023 yil 07 mart
