PCR reagentlarining dastlabki bosqichida primerlar va zondlarning ishlashini tekshirish va eng mos reaktsiya sharoitlarini aniqlash rasmiy tajribalarning muammosiz rivojlanishini ta'minlash uchun zarur shartdir.
Xo'sh, dastlabki bosqichda primer probini qanday tasdiqlashimiz kerak?
Asosiy ko'rsatkichlar - asosiy chiziq, kuchaytirish egri chizig'i, ct qiymati, kuchaytirish samaradorligi, past konsentratsiyali namunani aniqlash, CV va boshqalar.
Asosiy
Asosiy chiziq PCR kuchaytirish egri chizig'idagi gorizontal chiziqdir.PCR kuchaytirish reaksiyasining dastlabki bir necha davrlarida floresans signali unchalik o'zgarmaydi va to'g'ri chiziq hosil qiladi.Ushbu to'g'ri chiziq asosiy chiziqdir.
PCR primer problarini skrining paytida, asosiy chiziq darajasiga e'tibor bering.Primer prob kontsentratsiyasining tozaligi asosiy chiziqqa ta'sir qiladi, masalan, asosiy chiziqning ko'tarilishi yoki tushishiga olib keladi.Asosiy chiziq ham juda intuitiv ko'rsatkichdir.
Kuchaytirish egri chizig'i
Yana bir intuitiv ko'rsatkich - kuchaytirish egri chizig'ining shakli.Ikkilamchi kuchaytirish yoki boshqa g'ayritabiiy kuchaytirish egri chizig'idan qochish uchun S shaklidagi egri chiziqqa ega bo'lish yaxshidir.
Ct qiymati
Asosiy chiziqdan eksponensial o'sishgacha bo'lgan burilish nuqtasiga mos keladigan tsikllar soni Ct qiymatidir.
Xuddi shu namuna uchun turli xil primer problari turli xil kuchaytirish egri chiziqlariga olib keladi va mos keladigan Ct qiymatiga kuchaytirish samaradorligi va shovqin darajasi ta'sir qiladi.Nazariy jihatdan, biz tanlagan primer probning Ct qiymati qanchalik kichik bo'lsa, shuncha yaxshi bo'ladi.
Kuchaytirish samaradorligi
PCRni kuchaytirish samaradorligini baholashning eng ishonchli va barqaror usullaridan biri bu standart egri chiziq bo'lib, u ham tadqiqotchilar tomonidan keng e'tirof etilgan.Usul maqsadli shablonlarning nisbiy sonini nazorat qilish uchun bir qator namunalar yaratishni o'z ichiga oladi.Ushbu namunalar odatda konsentrlangan eritmalarning ketma-ket suyultirilishi bilan tayyorlanadi, eng ko'p ishlatiladigan 10 marta suyultirishdir.Bir qator suyultirilgan namunalardan foydalanib, Cq qiymatini olish uchun kuchaytirish uchun standart qPCR dasturidan foydalaning va nihoyat Cq= -klgX0+b chiziqli tenglamasini va kuchaytirish samaradorligi E=10(-1 /k)-1ni olish uchun har bir namunaning konsentratsiyasi va mos keladigan Cq qiymatiga muvofiq standart egri chizing.Miqdoriy tahlil uchun qPCR dan foydalanilganda, kuchaytirish samaradorligi 90%-110% (3,6>k>3,1) oralig'ida bo'lishi talab qilinadi.
Past konsentratsiyali namunalarni aniqlash
Namuna kontsentratsiyasi past bo'lsa, turli primer problarini aniqlash tezligi har xil bo'ladi.Biz takrorlash uchun 20 ta past konsentratsiyali namunani tanlaymiz va eng yuqori aniqlash tezligiga ega primer-zond tizimi eng yaxshisidir.
Variatsiya koeffitsienti (CV)
Nuklein kislota kuchayishini aniqlash uchun reagentning chiziqli standartiga muvofiq 10 ta dublikat namunani turli primer problari bilan aniqlash mumkin.
Miqdoriy reagentlar:
Aniqlik
Bitta partiya ichidagi aniqlik quyidagilarga javob berishi kerak: sinov konsentratsiyasining logarifmik qiymatining o'zgarish koeffitsienti (CV,%) ≤5%.Namuna kontsentratsiyasi past bo'lsa, aniqlash kontsentratsiyasi logarifmining o'zgarish koeffitsienti (CV,%) ≤10% ni tashkil qiladi.
Sifatli reaktivlar:
Aniqlik
Bitta to'plamdagi aniqlik quyidagilarga javob berishi kerak:
(1) Ct qiymatining o'zgarish koeffitsienti (CV,%) ≤5%
Xuddi shu namuna 10 marta parallel ravishda sinovdan o'tkaziladi va test natijalari izchil bo'lishi kerak
Yuborilgan vaqt: 2021 yil 18-sentabr
