Ishonamanki, har bir kishi PCR reaktsiyalarini amalga oshirishda har doim shunday yoki shunga o'xshash muammolarga duch keladi, ammo ularning aksariyatini ikkita asosiy muammoga ajratish mumkin:

Gen shablonining juda kam kuchaytirilishi (amplifikasyon);
Maqsadli bo'lmagan genlarni juda ko'p kuchaytirish.
Qo'shimchalardan foydalanish ushbu muammolarni hal qilishning umumiy strategiyalaridan biridir.Odatda qo'shimchalarning roli ikki jihatga ega:
ikkilamchi tuzilmagenlar (ikkilamchi tuzilish);
Maxsus bo'lmagan astarlashni kamaytiring.
Bugun muharrir sizni PCR reaktsiyalarida keng tarqalgan qo'shimchalar va ularning funktsiyalari bilan qisqacha tanishtiradi.
Ikkilamchi tuzilmani kamaytiradigan qo'shimchalar
sulfoksid(DMSO)
gen namunalariyuqori GC tarkibi bilan.Biroq, DMSO Taq polimeraza faolligini ham sezilarli darajada kamaytiradi.Shuning uchun, har bir kishi shablonning mavjudligi va polimeraza faolligini muvozanatlashi kerak.Tahrirlovchi tajribangizga mos keladigan kontsentratsiyani topish uchun DSMO ning turli konsentrasiyalarini, masalan, 2% dan 10% gacha sinab ko'rishingizni taklif qiladi.
Ion bo'lmagan yuvish vositalari
0,1-1% Triton X-100, Tween 20 yoki NP-40 kabi ion bo'lmagan yuvish vositalari odatda DNKning ikkilamchi tuzilishini kamaytiradi.Garchi bu shablon genining kuchayishini oshirishi mumkin bo'lsa-da, bu o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirish muammosini ham keltirib chiqaradi.Shunday qilib, bu qo'shimchalar qoldiqsiz past rentabellikli PCR reaktsiyalari uchun yaxshi ishlaydi, ammo nisbatan nopok XXR reaktsiyalari uchun unchalik yaxshi emas.Ion bo'lmagan yuvish vositalarining yana bir afzalligi SDS ifloslanishini kamaytirishdir.Odatda DNK ekstraktsiyasi jarayonida SDS polimeraza faolligini sezilarli darajada inhibe qiluvchi PCR bosqichiga olib keladi.Shuning uchun reaktsiyaga 0,5% Tween-20 yoki Tween-40 qo'shilishi SDS ning salbiy ta'sirini zararsizlantirishi mumkin.
Betain_
Betain ikkilamchi struktura shakllanishini kamaytirish orqali DNK kuchaytirilishini yaxshilashi mumkin va odatda tijorat PCR to'plamlariga "sirli" qo'shimcha hisoblanadi.Agar siz betaindan foydalanmoqchi bo'lsangiz, betain yoki betain mono-gidrat (Betain yoki Betain mono-gidrat) qo'yishingiz kerak, lekin betain gidroxlorid (Betain HCl) emas, 1-1,7M yakuniy konsentratsiyasiga sozlang.Betain shuningdek, o'ziga xoslikni yaxshilashga yordam beradi, chunki u DNKning erishi / DNK denatüratsiyasining asosiy juftlik tarkibiga bog'liqligini yo'q qiladi.
Maxsus bo'lmagan astarni kamaytirish uchun qo'shimchalar
Formamid
Formamid keng tarqalgan ishlatiladigan organik PCR qo'shimchasidir.U DNKdagi asosiy yiv va kichik truba bilan birlashishi mumkin, shu bilan asosiy DNK juft spiralining barqarorligini pasaytiradi va DNKning erish haroratini pasaytiradi.PCR tajribalarida ishlatiladigan formamid konsentratsiyasi odatda 1% -5% ni tashkil qiladi.
tetrametilammoniy xlorid( TMAC)
Tetrametilammoniy xlorid gibridlanishning o'ziga xosligini (gibridlanishning o'ziga xosligini) oshirishi va DNKning erish haroratini oshirishi mumkin.Shunday qilib, TMAC o'ziga xos bo'lmagan primingni olib tashlashi va DNK va RNKning noto'g'ri bog'lanishini kamaytirishi mumkin.Agar foydalansangizdegenerativ primerlarPCR reaktsiyasida odatda 15-100 mM konsentratsiyada ishlatiladigan TMAC qo'shishni unutmang.
Boshqa umumiy qo'shimchalar
Yuqorida aytib o'tilgan ikki toifadagi qo'shimchalardan tashqari, PCR reaktsiyalarida ko'plab umumiy qo'shimchalar mavjud, garchi ular turli funktsiyalarga ega bo'lsa-da, ular ham juda muhimdir.
Magniy ioni
Magniy ioni polimerazaning ajralmas kofaktori (kofaktori), ya'ni magniy ionisiz polimeraza faol emas.Biroq, juda ko'p magniy ionlari ham polimeraza samaradorligiga ta'sir qilishi mumkin.Har bir PCR reaktsiyasida magniy ionlarining kontsentratsiyasi o'zgaradi.Xelatlovchi moddalar (masalan, EDTA yoki sitrat), dNTP va oqsillarning kontsentratsiyasi magniy ionlarining kontsentratsiyasiga ta'sir qiladi.Shunday qilib, agar siz PCR tajribangiz bilan bog'liq muammolarga duch kelsangiz, turli xil magniy ionlari kontsentratsiyasini o'zgartirishga harakat qilishingiz mumkin, masalan, 1,0 dan 4,0 mM gacha, ular orasidagi interval 0,5-1 mM.
Shunisi e'tiborga loyiqki, muzlash-eritishning bir nechta tsikllari magniy xlorid eritmasining kontsentratsiyasining tabaqalanishiga olib kelishi mumkin.Shuning uchun har foydalanishdan oldin uni butunlay eritib, ishlatishdan oldin yaxshilab aralashtirish kerak.
Sigir zardobidagi albumin(Bovine albumin, BSA)
Molekulyar kimyo tajribalarida, qoramol zardobidagi albumin juda keng tarqalgan qo'shimcha hisoblanadi, ayniqsa cheklovchi ferment hazm qilish va PCR tajribalarida.PCR reaktsiyalarida BSA fenolik birikmalar kabi ifloslantiruvchi moddalarni kamaytirishda yordam beradi.Shuningdek, u reaktivlarning probirka devoriga yopishishini kamaytirishi mumkinligi ham aytiladi.PCR reaktsiyasida odatda qo'shilgan BSA kontsentratsiyasi 0,8 mg / ml ga yetishi mumkin.
 
Tegishli mahsulotlar:
PCR qahramoni(bo'yoq bilan)
PCR qahramoni