To'g'ridan-to'g'ri PCR - bu nuklein kislotasi ekstraktsiyasisiz kuchaytirish uchun hayvon yoki o'simlik to'qimalaridan bevosita foydalanadigan reaktsiya.Ko'p jihatdan, to'g'ridan-to'g'ri PCR oddiy PCR kabi ishlaydi

Asosiy farq to'g'ridan-to'g'ri PCRda qo'llaniladigan maxsus tampondir, namuna nuklein kislotasi ekstraktsiyasisiz to'g'ridan-to'g'ri PCR reaktsiyasiga duchor bo'lishi mumkin, ammo to'g'ridan-to'g'ri PCR reaktsiyasida ishtirok etadigan fermentlarning bardoshliligi va buferning mosligi uchun tegishli talablar mavjud.

Umumiy namunalarda PCR inhibitörleri ko'p yoki kamroq bo'lsa-da, to'g'ridan-to'g'ri PCR fermentlar va tamponlar ta'sirida ishonchli kuchaytirilishiga erishish mumkin.An'anaviy PCR reaktsiyasi shablon sifatida yuqori sifatli nuklein kislotani talab qiladi, agar shablonda oqsillar va boshqa aralashmalar bo'lsa, PCR reaktsiyasining silliq rivojlanishiga to'sqinlik qilishi mumkin.To'g'ridan-to'g'ri PCR hozirda molekulyar diagnostika sohasidagi eng mashhur texnologiyalardan biridir.

01 Direct PCR dastlab hayvonlar va o'simliklar uchun ishlatilgan

To'g'ridan-to'g'ri PCRning eng erta qo'llanilishi hayvonlar va o'simliklar sohasida, masalan, kalamush, mushuk, tovuq, quyon, qo'y, qoramol va boshqalarning qoni, to'qimasi va sochlari, o'simlik barglari va urug'lari va boshqalar, genotiplashni o'rganish, transgenik, plazmidlarni aniqlash, gen nokautini tahlil qilish, DNK manbasini aniqlash, turlarni aniqlash va boshqa sohalarda.

Bu maydonlar ba'zi umumiy xususiyatlarga ega, ya'ni maqsadli gen tarkibi nisbatan yuqori va nuklein kislota ekstraktsiyasi muammoli, shuning uchun to'g'ridan-to'g'ri PCR nafaqat vaqtni tejash va natijalarga ozgina ta'sir ko'rsatishi, balki xarajatlarni ham tejashi mumkin.

Patogenni aniqlash uchun ishlatiladigan to'g'ridan-to'g'ri PCR so'nggi yillardagi masala bo'lib, ba'zi PCR reagentlari ishlab chiqaruvchilari innovatsiyalarni amalga oshirishda ushbu yo'nalishda juda ko'p harakat qilishdi.Ayniqsa, ushbu COVID-19 epidemiyasida, Foregene tomonidan tadqiq qilingan va ishlab chiqilgan SARS-CoV-2 nuklein kislotasini aniqlash to'plami (Multiplex PCR lyuminestsent prob usuli) kabi ko'plab aniqlash mahsulotlari bozorda paydo bo'ldi. bo'yinbog'i tampon namunalari.

Foregene oddiy ORF1ab, N, E va aniqlash uchun Direct PCR texnologiyasidan foydalanadigan kompaniyalardan biridir.variant SARS-CoV-2 B.1.1.7 lineage (Buyuk Britaniya), B.1.351 lineage (ZA), B.1.617 lineage (IND) va P.1 lineage (BR) kabi insonning nazofarengeal yoki orofaringeal tampon namunalaridagi nasl-nasablar nuklein kislotalari.

02  To'g'ridan-to'g'ri PCR uchun zarur bo'lgan reaktivlar

Lizat namunasi

Namuna lizatini o'zingiz sozlashingiz yoki sotib olishingiz mumkin.Lizatning turli markalari tarkibidagi farq lizing qobiliyatini har xil qiladi, keyin esa lizing vaqti biroz farq qiladi.Misol uchun, hayvonlarning to'qimalari namunalarini tayyorlash uchun odatda 30 daqiqa yoki bir kechada lizis tavsiya etiladi va viruslar uchun lizis eritmasi 3-10 minut oralig'ida.

PCR master aralashmasi

Maxsus kuchaytirgichni kuchaytirish va kuchaytirish qobiliyatini oshirish uchun issiq ishga tushirilgan DNK polimerazasini qo'llash tavsiya etiladi.To'g'ridan-to'g'ri PCRning yadrosi yuqori bardoshli polimerazadir.

Namunadagi DNK kuchaytirilishiga ta'sir qiluvchi komponentlarni yo'q qiling yoki inhibe qiling

Namuna lizat, oqsillar, lipidlar va boshqa hujayra qoldiqlari bilan ishlov berilgandan so'ng, bu moddalar PCR reaktsiyasini inhibe qiladi.Shuning uchun to'g'ridan-to'g'ri PCR ushbu omillarning ta'sirini kamaytirish uchun mos keladigan olib tashlash yoki inhibitorlarni qo'shishni talab qiladi.

03  To'g'ridan-to'g'ri PCRning beshta bilim nuqtasi to'plami

Birinchidan, Direct PCR texnologiyasi turli biologik namunalar uchun bevosita PCR texnologiyasidir.Ushbu texnik shartda, nuklein kislotani ajratish va ajratib olish, to'qima namunasini ob'ekt sifatida to'g'ridan-to'g'ri ishlatish va PCR reaktsiyasini amalga oshirish uchun maqsadli gen primerlarini qo'shishning hojati yo'q.

Ikkinchidan, Direct PCR texnologiyasi nafaqat an'anaviy DNK shablonini kuchaytirish texnologiyasi, balki RNK shablonini teskari transkripsiyali PCRni ham o'z ichiga oladi.

Uchinchidan, Direct PCR texnologiyasi nafaqat to'qimalar namunalarida muntazam sifatli PCR reaktsiyalarini amalga oshiradi, balki Real-Time qPCR reaktsiyalarini ham o'z ichiga oladi, bu reaktsiya tizimi kuchli fonga qarshi floresan shovqin qobiliyatiga ega bo'lishini va endogen floresansning antagonistik qobiliyatga ega bo'lishini talab qiladi.

To'rtinchidan, Direct PCR texnologiyasiga mo'ljallangan namunalar faqat nuklein kislota shablonlarini chiqarishni talab qiladi va PCR reaktsiyasiga xalaqit beradigan oqsillarni, polisakkaridlarni, tuz ionlarini va boshqalarni olib tashlamaydi.Reaksiya tizimidagi nuklein kislota polimeraza va PCR aralashmasi murakkab sharoitlarda ferment faolligi va replikatsiya aniqligini ta'minlash uchun mukammal qarshilik va moslashuvchanlikka ega bo'lishini talab qiladi.

Beshinchidan, nuklein kislotani boyitish bilan davolashsiz Direct PCR texnologiyasi bilan mo'ljallangan to'qimalar namunasi va shablon miqdori juda kichik, bu reaktsiya tizimining juda yuqori sezuvchanlik va kuchaytirish samaradorligini talab qiladi.