qPCR tajribalarida primer dizayni ham juda muhim havola hisoblanadi.Primerlar mos keladimi yoki yo'qmi, kuchaytirish samaradorligi standartga etib boradimi, kuchaytirilgan mahsulotlarning o'ziga xosligi va eksperimental natijalar mavjudligi bilan chambarchas bog'liq.
Xo'sh, qPCR primerining o'ziga xosligini qanday yaxshilash mumkin?Yuqori kuchaytirish samaradorligi?
Bugun biz sizni qPCR primerlarini birgalikda loyihalashga olib boramiz va qPCR primer dizayni tajribalarda samarali bilimga aylanishiga imkon beramiz.
QPCR primerlarini loyihalashda, odatda, quyidagi fikrlarga e'tibor bering: primerlar iloji boricha intronlar bo'ylab ishlab chiqilishi kerak, mahsulot uzunligi 100-300 bp bo'lishi kerak, Tm qiymati imkon qadar 60 ° C ga yaqin bo'lishi kerak va yuqori va quyi oqim primerlari iloji boricha yaqin bo'lishi kerak va primerning oxiri G yoki C va hokazo kutish kerak.
1. Intronlarni qamrab oluvchi primerlarning dizayni
qPCR primerlarini loyihalashda intronlar bo'ylab ishlab chiqilgan primerlarni tanlash gDNK shablonini kuchaytirishga to'sqinlik qilishi mumkin va mahsulotlarning barchasi cDNKning kuchaytirilishidan kelib chiqadi va shu bilan gDNK ifloslanishining ta'sirini yo'q qiladi.
2. Astar uzunligi
Astar uzunligi odatda 18-30 nt oralig'ida va kuchaytirish mahsulotining uzunligi imkon qadar 100-300 bp oralig'ida nazorat qilinishi kerak.
Agar primer juda qisqa bo'lsa, u o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirishga olib keladi va agar u juda uzun bo'lsa, u osonlik bilan ikkilamchi tuzilmani hosil qiladi (masalan, soch turmagi tuzilishi).Agar kuchaytiruvchi mahsulot juda uzun bo'lsa, u polimeraza reaktsiyasi uchun mos emas, bu PCR kuchaytirilishining samaradorligiga ta'sir qiladi.
3. GC tarkibi va Tm qiymati
Primerlarning GC tarkibini 40% dan 60% gacha nazorat qilish kerak.Agar u juda yuqori yoki juda past bo'lsa, bu reaktsiyani boshlash uchun qulay emas.Bir xil Tm qiymatini va tavlanish haroratini olish uchun oldinga va teskari primerlarning GC tarkibi bir xil bo'lishi kerak.
Tm qiymati imkon qadar 55-65 ° S gacha, odatda 60 ° C atrofida bo'lishi kerak va yuqori va quyi oqimning Tm qiymati imkon qadar yaqin bo'lishi kerak, tercihen 4 ° C dan oshmasligi kerak.
4. Astarning 3′ uchida A ni tanlashdan saqlaning
Primerning 3' uchi mos kelmasa, turli asoslarning sintez samaradorligida katta farqlar mavjud.Oxirgi tayanch A bo'lsa, u hatto nomuvofiqlik holatida ham zanjir sintezini boshlashi mumkin va oxirgi asos T bo'lganda, mos kelmaslik induksiyasi samaradorligi sezilarli darajada kamayadi.Shuning uchun, primerning 3′ uchida A ni tanlashdan qochishga harakat qiling va T ni tanlash yaxshidir.
Agar u zond primeri bo'lsa, probning 5' uchi G bo'lishi mumkin emas, chunki FAM lyuminestsent reportyorlar guruhiga bitta G bazasi ulangan bo'lsa ham, G FAM guruhi tomonidan chiqarilgan lyuminestsent signalni o'chirishi mumkin, bu noto'g'ri salbiy natijalarga olib keladi.Ko'rinish.
5. Baza taqsimoti
Primerdagi to'rtta asosning taqsimlanishi afzal tasodifiy bo'lib, 3' oxirida ketma-ket 3 dan ortiq G yoki C dan va ketma-ket 3 dan ortiq ketma-ketlikdan qochadi.G yoki C ni GCga boy ketma-ketlik hududida juftlashtirish oson.
6. Primer dizayn hududi murakkab ikkilamchi tuzilmalardan qochish kerak.
Kuchaytiruvchi mahsulotning bitta ipidan hosil bo'lgan ikkilamchi tuzilma PCRning silliq rivojlanishiga ta'sir qiladi.Maqsadli ketma-ketlikda ikkilamchi tuzilma mavjudligini oldindan taxmin qilib, primerlarni loyihalashda ushbu hududdan qochishga harakat qiling.
7. Astarlarning o'zlari va primerlar orasidagi ketma-ket qo'shimcha asoslardan qochishga harakat qilishlari kerak.
Astarning o'zi va astar o'rtasida ketma-ket 4 ta asosiy to'ldiruvchi bo'lishi mumkin emas.Astarning o'zi bir-birini to'ldiruvchi ketma-ketlikka ega bo'lmasligi kerak, aks holda u o'zini buklanib, soch tolasi tuzilishini hosil qiladi, bu astar va shablonning tavlanadigan kombinatsiyasiga ta'sir qiladi.
Yuqori va quyi oqim primerlari o'rtasida qo'shimcha ketma-ketliklar mavjud bo'lishi mumkin emas.Primerlar orasidagi to'ldiruvchilik primer dimerlarini ishlab chiqaradi, bu PCR samaradorligini pasaytiradi va hatto miqdoriy aniqlikka ta'sir qiladi.Agar primer-dimer va soch turmagi tuzilmalari muqarrar bo'lsa, △G qiymati juda yuqori bo'lmasligi kerak (4,5 kkal / mol dan kam bo'lishi kerak).
8. Primerlar maqsadli maxsus mahsulotni kuchaytiradi.
QPCR aniqlashning yakuniy maqsadi maqsadli genning ko'pligini tushunishdir.Agar o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirish sodir bo'lsa, miqdorni aniqlash noto'g'ri bo'ladi.Shuning uchun, primerlar ishlab chiqilgandan so'ng, ular BLAST tomonidan sinovdan o'tkazilishi kerak va mahsulotlarning o'ziga xosligi ketma-ketlik ma'lumotlar bazasida taqqoslanadi.
Keyinchalik, biz qPCR primerlarini loyihalash uchun misol sifatida insonning GAS6 (o'sishning oldini olish uchun maxsus 6) genini olamiz.
01 so'rov geni
Homo GAS6NCBI orqali.Bu erda biz gen nomi va turlarini solishtirishga e'tibor qaratishimiz kerak, bu ularning izchilligini ta'minlash uchun.
02 Gen ketma-ketligini toping
(1) Agar maqsadli ketma-ketlik genomik DNK bo'lsa, genning genomik DNK ketma-ketligi bo'lgan birinchisini tanlang.
(2) Agar maqsadli ketma-ketlik mRNK bo'lsa, ikkinchisini tanlang.Kiritgandan so'ng, quyidagi jadvaldagi "CDS" tugmasini bosing.Jigarrang fon ketma-ketligi genning kodlash ketma-ketligidir.
03 Dizayn astarlari
Primer-BLAST interfeysini kiriting
Yuqori chap tomonda gen tartib raqamini yoki Fasta formatidagi ketma-ketlikni kiriting va tegishli parametrlarni to'ldiring.

“Primerlarni olish” tugmasini bosing va NCBI ochiladi va bunday parametr tanlash boshqa biriktiruvchi variantlarga kuchaytirilishini bildiradi.Biz turli xil biriktirish variantlarini tekshirishimiz va tegishli primer juftligini olish uchun ularni yuborishimiz mumkin (quyidagi rasmda ko'rsatilganidek).Bu jarayonni bajarish uchun o'nlab soniyalar ketishi mumkin.
Ushbu primer juftlarining tavlanish harorati 60 ° C atrofida.Tajribaning maqsadiga ko'ra, o'rtacha uzunlikdagi, yaxshi o'ziga xoslik va tajriba uchun primerlarning o'zini kamroq to'ldiradigan primerlarni tanlang va muvaffaqiyat darajasi ancha yuqori!
04Primerning o'ziga xosligini tekshirish
Aslida, primerlarni loyihalashdan tashqari, Primer-Blast biz o'zimiz ishlab chiqqan primerlarni ham baholashi mumkin.Astar dizayni sahifasiga qayting, biz ishlab chiqqan yuqori va quyi oqimlarni kiriting va boshqa parametrlar o'rnatilmaydi.Taqdim etilgandan so'ng, primerlar juftligi boshqa genlarda ham mavjudligini ko'rishingiz mumkin.Agar ularning barchasi biz kuchaytirmoqchi bo'lgan genda ko'rsatilsa, bu primerlar juftligining o'ziga xosligi ajoyib ekanligini ko'rsatadi!(Masalan, bu asosiy so'rovning yagona natijasidir!)

05 Primer sifatini baholash
"Standartgacha kuchaytirish samaradorligi", "mahsulotning kuchaytirilgan xarakteristikalari" va "ishonchli eksperimental natijalar" ni birlashtirgan "mukammal" primer qanday primer hisoblanadi?
Amplifikatsiya samaradorligi

erish egri chizig'i
Primerlarning kuchaytirish samaradorligi 90% -110% ga etadi, ya'ni kuchaytirish samaradorligi yaxshi va erish egri chizig'i bir cho'qqiga ega va odatda Tm>80 ° C ga teng, ya'ni kuchaytirish o'ziga xosligi yaxshi.
 
Tegishli mahsulotlar:
Real Time PCR Easy – SYBR GREEN I
Real Time PCR Easy-Taqman