Molekulyar diagnostika texnologiyasi kasalliklarni bashorat qilish va tashxislash maqsadiga erishish uchun inson tanasi va turli patogenlarning genetik materialining ifodasi va tuzilishini aniqlash uchun molekulyar biologiya usullaridan foydalanadi.

So'nggi yillarda molekulyar diagnostika texnologiyasini yangilash va iteratsiya qilish bilan molekulyar diagnostikaning klinik qo'llanilishi tobora kengroq va chuqurlashdi va molekulyar diagnostika bozori jadal rivojlanish davriga kirdi.

Muallif bozorda keng tarqalgan molekulyar diagnostika texnologiyalarini umumlashtiradi va uch qismga bo'linadi: birinchi qismda PCR texnologiyasi, ikkinchi qismda nuklein kislotasini izotermik kuchaytirish texnologiyasi va ikkinchi qismda ketma-ketlik texnologiyasi taqdim etiladi.

01

I qism: PCR texnologiyasi

PCR texnologiyasi

PCR (polimeraza zanjiri reaktsiyasi) 30 yildan ortiq tarixga ega bo'lgan in vitro DNKni kuchaytirish texnologiyalaridan biridir.

PCR texnologiyasi 1983 yilda AQShning Ketus shahridan Kari Mullis tomonidan kashf etilgan.Mullis 1985 yilda PCR patentiga murojaat qildi va o'sha yili Fan bo'yicha birinchi PCR akademik maqolasini nashr etdi.Mullis 1993 yilda kimyo bo'yicha Nobel mukofotiga sazovor bo'ldi.

PCRning asosiy tamoyillari

PCR maqsadli DNK fragmentlarini bir million martadan ko'proq oshirishi mumkin.Printsip shundaki, DNK polimeraza katalizi ostida DNKning asosiy zanjiri shablon sifatida ishlatiladi va ma'lum bir primer kengaytirish uchun boshlang'ich nuqta sifatida ishlatiladi.U in vitro denaturatsiya, tavlanish va kengaytirish kabi bosqichlar orqali takrorlanadi.DNKning asosiy zanjir shablonini to'ldiruvchi qiz zanjiri DNK jarayoni.

Standart PCR jarayoni uch bosqichga bo'lingan:

1. Denatürasyon: DNKning qo'sh iplarini ajratish uchun yuqori haroratdan foydalaning.DNK qo'sh zanjirlari orasidagi vodorod bog'lari yuqori haroratda (93-98 ° C) buziladi.

2. Yuvish: Ikki ipli DNK ajratilgandan so'ng, primer bir ipli DNK bilan bog'lanishi uchun harorat tushiriladi.

3. Kengaytma: DNK polimeraza harorat tushirilganda bog'langan primerlardan DNK zanjirlari bo'ylab komplementar iplarni sintez qila boshlaydi.Kengaytma tugagach, tsikl tugallanadi va DNK fragmentlari soni ikki barobar ortadi.

Ushbu uch bosqichni 25-35 marta takrorlash, DNK fragmentlari soni eksponent ravishda oshadi.

PCRning zukkoligi shundaki, turli xil primerlar turli maqsadli genlar uchun mo'ljallangan bo'lishi mumkin, shuning uchun maqsadli gen bo'laklari qisqa vaqt ichida kuchaytirilishi mumkin.

Hozirgacha PCRni uchta toifaga bo'lish mumkin, ya'ni oddiy PCR, floresan miqdoriy PCR va raqamli PCR.

Oddiy PCRning birinchi avlodi

Maqsadli genni kuchaytirish uchun oddiy PCR kuchaytiruvchi asbobdan foydalaning va keyin mahsulotni aniqlash uchun agaroz jel elektroforezidan foydalaning, faqat sifatli tahlil qilish mumkin.

Birinchi avlod PCR ning asosiy kamchiliklari:

-Spesifik bo'lmagan kuchaytirishga va noto'g'ri ijobiy natijalarga moyil.

-Aniqlash uzoq davom etadi va operatsiya mashaqqatli.

-Faqat sifatli test o'tkazish mumkin.

Ikkinchi avlod floresan miqdoriy PCR

Floresan miqdoriy PCR (Real-Time PCR), shuningdek, qPCR nomi bilan ham tanilgan, reaktsiya tizimining borishini ko'rsatadigan floresan zondlarni qo'shish orqali floresan signallarni to'plash orqali kuchaytirilgan mahsulotlarning to'planishini kuzatish va natijalarni flüoresan egri chizig'i orqali baholash uchun ishlatiladi va C egri chizig'ining standart qiymati yordamida aniqlanishi mumkin.

qPCR texnologiyasi yopiq tizimda amalga oshirilganligi sababli, ifloslanish ehtimoli kamayadi va floresan signal miqdoriy aniqlash uchun kuzatilishi mumkin, shuning uchun u klinik amaliyotda eng ko'p qo'llaniladi va PCRda dominant texnologiyaga aylandi.

Haqiqiy vaqtda lyuminestsent miqdoriy PCRda ishlatiladigan floresan moddalarni quyidagilarga bo'lish mumkin: TaqMan floresan problari, molekulyar mayoqlar va floresan bo'yoqlar.

1) TaqMan lyuminestsent probi:

PCR amplifikatsiyasi vaqtida bir juft primer qo'shilganda ma'lum bir flüoresan prob qo'shiladi.Prob oligonukleotid bo'lib, ikkala uchi mos ravishda muxbir floresan guruhi va söndürücü floresan guruhi bilan etiketlanadi.

Prob buzilmagan bo'lsa, muxbirlar guruhi tomonidan chiqarilgan floresan signal söndürme guruhi tomonidan so'riladi;PCR kuchaytirilishi paytida Taq fermentining 5'-3' eksonukleaza faolligi zondni parchalaydi va degradatsiya qiladi, bu esa lyuminestsent guruhini va so'ndiruvchini qiladi. signal PCR mahsulotining shakllanishi bilan to'liq sinxronlashtiriladi.

2) SYBR floresan bo'yoqlari:

PCR reaktsiya tizimida ortiqcha SYBR floresan bo'yoq qo'shiladi.SYBR lyuminestsent bo'yog'i o'ziga xos bo'lmagan holda DNKning qo'sh zanjiriga kiritilgandan so'ng, u flüoresan signal chiqaradi.Zanjirga kiritilmagan SYBR bo'yoq molekulasi hech qanday lyuminestsent signalni chiqarmaydi, shu bilan floresan signalni ta'minlaydi PCR mahsulotlarining ko'payishi PCR mahsulotlarining ko'payishi bilan to'liq sinxronlashtiriladi.SYBR faqat ikki zanjirli DNK bilan bog'lanadi, shuning uchun erish egri PCR reaktsiyasining o'ziga xosligini aniqlash uchun ishlatilishi mumkin.

3) Molekulyar mayoqlar

Bu 5 va 3 uchlarida taxminan 8 ta asosdan iborat soch tolasi tuzilishini tashkil etuvchi ikki tomonlama yorliqli oligonükleotid zondi.Ikkala uchidagi nuklein kislota ketma-ketligi bir-birini to'ldiruvchi tarzda juftlanadi, bu esa floresan guruhi va söndürme guruhining qattiq bo'lishiga olib keladi.Yopiq, u floresan hosil qilmaydi.

PCR mahsuloti ishlab chiqarilgandan so'ng, yumshatish jarayonida molekulyar mayoqning o'rta qismi ma'lum bir DNK ketma-ketligi bilan bog'lanadi va floresan gen floresan hosil qilish uchun söndürme genidan ajratiladi.

Ikkinchi avlod PCR ning asosiy kamchiliklari:

Sezuvchanlik hali ham etishmayapti va kam nusxadagi namunalarni aniqlash aniq emas.

Orqa fon qiymati ta'siri mavjud va natija shovqinga moyil.

Uchinchi avlod raqamli PCR

Raqamli PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) oxirgi nuqtani aniqlash orqali maqsadli ketma-ketlikning nusxasi raqamini hisoblab chiqadi va ichki nazorat va standart egri chiziqlardan foydalanmasdan aniq mutlaq miqdoriy aniqlashni amalga oshirishi mumkin.

Raqamli PCR so'nggi nuqtani aniqlashdan foydalanadi va Ct qiymatiga (tsikl chegarasi) bog'liq emas, shuning uchun raqamli PCR reaktsiyasi kuchaytirish samaradorligidan kamroq ta'sirlanadi va PCR reaktsiyasi inhibitörlerine tolerantlik yaxshilanadi, yuqori aniqlik va takrorlanishi mumkin.

Yuqori sezuvchanlik va yuqori aniqlik xususiyatlariga ko'ra, u PCR reaktsiyasi inhibitörleri tomonidan osonlikcha aralashmaydi va tadqiqot va dastur nuqtasiga aylangan standart mahsulotlarsiz haqiqiy mutlaq miqdorni aniqlashga erisha oladi.

Reaksiya birligining turli shakllariga ko'ra, uni uch turga bo'lish mumkin: mikrosuyuqlik, chip va tomchi tizimlar.