Ct qiymati lyuminestsent miqdoriy PCR natijalarini ko'rsatishning eng muhim shaklidir.U gen ifodasi farqlarini yoki gen nusxasi sonini hisoblash uchun ishlatiladi.Xo'sh, floresan miqdorini aniqlashning Ct qiymati qanday hisoblanadi?Ct qiymatining samarali diapazonini qanday ta'minlash mumkin?
Ct qiymati nima?
qPCR kuchaytirish jarayonida, kuchaytirilgan mahsulotning floresans signali o'rnatilgan floresans chegarasiga yetganda, kuchaytirish davrlarining mos keladigan soni (Tsikl chegarasi).C Cycle, T esa polni anglatadi.Oddiy qilib aytganda, Ct qiymati - bu shablonning dastlabki kuchaytirilishi qPCR da mahsulotning ma'lum miqdoriga yetganda mos keladigan tsikllar soni."Ma'lum miqdordagi mahsulot" deb ataladigan narsa keyinroq tushuntiriladi.
Ct qiymati nima qiladi?
1.Eksponensial kuchaytirish, shablon miqdori va Ct qiymati o'rtasidagi bog'liqlik
Ideal holda, qPCRdagi genlar ma'lum miqdordagi tsikllardan keyin eksponensial kuchaytirish orqali to'planadi.Kuchaytirish davrlari soni va mahsulotlar miqdori o'rtasidagi bog'liqlik: Kuchaytirilgan mahsulot miqdori = boshlang'ich shablon miqdori × (1+En) tsikllar soni.Biroq, qPCR reaktsiyasi har doim ham ideal holatda emas.Kuchaytirilgan mahsulot miqdori "ma'lum mahsulot miqdori" ga yetganda, bu vaqtda tsikllar soni Ct qiymati bo'lib, u eksponensial kuchaytirish davrida bo'ladi.Ct qiymati va boshlang'ich shablon miqdori o'rtasidagi munosabat: Shablonning Ct qiymati va shablonning boshlang'ich nusxasi raqamining logarifmi o'rtasida chiziqli bog'liqlik mavjud.Dastlabki shablon kontsentratsiyasi qanchalik yuqori bo'lsa, Ct qiymati shunchalik kichik bo'ladi;shablonning dastlabki konsentratsiyasi qanchalik past bo'lsa, Ct qiymati shunchalik katta bo'ladi.
2.Amplifikasiya egri chizig'i, floresans chegarasi va ma'lum PCR mahsulot miqdori
qPCR kuchaytiruvchi mahsulot miqdori to'g'ridan-to'g'ri floresan signal shaklida, ya'ni kuchaytirish egri chizig'ida taqdim etiladi.PCR ning dastlabki bosqichida kuchaytirish ideal sharoitlarda, tsikllar soni kichik, mahsulot to'planishi kichik va floresans darajasini floresan fondan aniq ajratib bo'lmaydi.Shundan so'ng, floresan kuchayadi va eksponent fazaga kiradi.PCR mahsulotining miqdori ma'lum bir nuqtada, PCR reaktsiyasi faqat eksponensial bosqichda bo'lganida aniqlanishi mumkin, bu "ma'lum miqdordagi mahsulot" sifatida ishlatilishi mumkin va shablonning boshlang'ich tarkibi shundan kelib chiqadi.Shuning uchun, ma'lum miqdordagi mahsulotga mos keladigan floresans signalining intensivligi floresans chegarasi hisoblanadi.
PCR ning kech bosqichida kuchaytirish egri chizig'i endi eksponensial kuchaytirishni ko'rsatmaydi va chiziqli fazaga va plato fazasiga kiradi.
3.Ct qiymatlarining takrorlanishi
PCR sikli Ct qiymatining sikl raqamiga yetganda, u hozirgina haqiqiy eksponensial kuchaytirish davriga kirdi.Hozirgi vaqtda kichik xatolik kuchaytirilmagan, shuning uchun Ct qiymatining takrorlanishi juda yaxshi, ya'ni bir xil shablon turli vaqtlarda yoki bir vaqtning o'zida turli naychalarda kuchaytiriladi.Kuchaytirish, olingan Ct qiymati doimiy.
1.Amplifikasiya samaradorligi En
PCR kuchaytirish samaradorligi polimeraza kuchaytiriladigan genni amplikonga aylantirish samaradorligini anglatadi.Bir DNK molekulasi ikkita DNK molekulasiga aylantirilganda kuchaytirish samaradorligi 100% ni tashkil qiladi.Kuchaytirish samaradorligi odatda En sifatida ifodalanadi.Keyingi maqolalarni tahlil qilishni osonlashtirish uchun kuchaytirish samaradorligiga ta'sir qiluvchi omillar qisqacha tanishtiriladi.
| Ta'sir etuvchi omillar | tushuntirish | Qanday hukm qilish kerak? |
| A. PCR inhibitörleri | 1. Shablon DNKda PCR reaktsiyasini inhibe qiluvchi moddalar, masalan, oqsillar yoki yuvish vositalari mavjud.2. Teskari transkripsiyadan so'ng cDNK shablon RNK yoki RT reagent komponentlarining yuqori konsentratsiyasini o'z ichiga oladi, bu ham keyingi PCR reaktsiyasini inhibe qilishi mumkin. | 1. Ifloslanish bor yoki yo'qligini A260/A280 va A260/A230 yoki RNK elektroforez nisbatlarini o'lchash orqali aniqlash mumkin.2. CDNK teskari transkripsiyadan keyin ma'lum nisbatga muvofiq suyultiriladimi. |
| B. Noto'g'ri astar dizayni | Primerlar samarali tavlanmaydi | Primer-dimerlar yoki soch turmagi, mos kelmasligi va ba'zan intronik dizaynlarni qamrab oladigan primerlarni tekshiring. |
| C. Noto'g'ri PCR reaktsiyasi dasturini loyihalash | 1. Primerlar samarali tavlana olmaydi2. DNK polimeraza ajralishi etarli emas 3. Uzoq muddatli yuqori haroratli DNK polimeraza faolligi kamaydi | 1. Yuvish harorati primerning TM qiymatidan yuqori2. Pre-denaturatsiya vaqti juda qisqa 3. Reaksiya protsedurasining har bir bosqichining vaqti juda uzun |
| D. Reagentlarni aralashtirishning etarli emasligi yoki pipetlash xatolari | Reaksiya tizimida PCR reaktsiyasi komponentlarining mahalliy kontsentratsiyasi juda yuqori yoki notekis bo'lib, PCR kuchaytirilishining eksponensial bo'lmagan kuchaytirilishiga olib keladi. | |
| E. Amplikon uzunligi | Amplikonning uzunligi juda uzun, 300bp dan oshadi va kuchaytirish samaradorligi past | Amplikon uzunligi 80-300bp orasida ekanligini tekshiring |
| F. qPCR reagentlarining ta'siri | Reagentdagi DNK polimeraza kontsentratsiyasi past yoki buferdagi ionlar konsentratsiyasi optimallashtirilmagan, buning natijasida Taq fermenti faolligi maksimal darajaga etmaydi. | Standart egri chiziq bo'yicha kuchaytirish samaradorligini aniqlash |
2.Ct qiymatlari diapazoni
Ct qiymatlari 15-35 oralig'ida.Agar Ct qiymati 15 dan kam bo'lsa, kuchaytirish asosiy davr oralig'ida va floresans chegarasiga erishilmagan deb hisoblanadi.Ideal holda, Ct qiymati va shablonning dastlabki nusxasi sonining logarifmi, ya'ni standart egri chiziq o'rtasida chiziqli bog'liqlik mavjud.Standart egri chiziq orqali, kuchaytirish samaradorligi 100% bo'lganda, genning yagona nusxasi sonini miqdoriy aniqlash uchun hisoblangan Ct qiymati 35 atrofida bo'ladi. Agar u 35 dan katta bo'lsa, shablonning dastlabki nusxasi soni nazariy jihatdan 1 dan kam bo'ladi, bu ma'nosiz deb hisoblanishi mumkin.
Turli xil gen Ct diapazonlari uchun, gen nusxasi soni va boshlang'ich shablon miqdoridagi kuchaytirish samaradorligidagi farq tufayli, gen uchun standart egri chiziq hosil qilish va genning chiziqli aniqlash diapazonini hisoblash kerak.
3.Ct qiymatining ta'sir etuvchi omillari
Kuchaytirish sikllari soni va mahsulot miqdori o'rtasidagi bog'liqlikdan: kuchaytirilgan mahsulot miqdori = boshlang'ich shablon miqdori × (1+En) sikl raqami, ideal sharoitlarda boshlang'ich shablonning miqdori va Enning Ct qiymatiga salbiy ta'sir ko'rsatishini ko'rish mumkin.Shablon sifati yoki kuchaytirish samaradorligidagi farq Ct qiymatining juda katta yoki juda kichik bo'lishiga olib keladi.
4.Ct qiymati juda katta yoki juda kichik
Xabar vaqti: 22-fevral-2023-yil
