PCR eng ko'p ishlatiladigan nuklein kislotani kuchaytirish texnologiyasi bo'lib, uning sezgirligi va o'ziga xosligi tufayli keng qo'llaniladi.Biroq, PCR qayta-qayta termal denatüratsiyani talab qiladi va asboblar va jihozlarga tayanish cheklovlaridan xalos bo'lolmaydi, bu uning klinik dala sinovlarida qo'llanilishini cheklaydi.

1990-yillarning boshidan beri ko'plab laboratoriyalar issiqlik denatüratsiyasini talab qilmaydigan doimiy haroratni kuchaytirish texnologiyasini ishlab chiqishni boshladilar.Endi ular pastadir vositasida izotermik kuchaytirish texnologiyasini, ipni almashtirish izotermik kuchaytirish texnologiyasini, aylana izotermik kuchaytirish texnologiyasini va nuklein kislotalar ketma-ketligiga bog'liqlikni ishlab chiqdilar.Izotermik kuchaytirish texnologiyasi va boshqa texnologiyalar. 

Loop vositachiligida izotermik kuchaytirish

Amplifikatsiya printsipi DNKning taxminan 65 ° C da dinamik muvozanat holatida bo'lishiga asoslanadi.Har qanday primer asosli juftlashganda va ikki zanjirli DNKning komplementar qismiga cho'zilganida, boshqa zanjir ajralib chiqadi va bir ipli bo'ladi.

Bu haroratda DNK zanjirli joy almashuvchi DNK polimerazasiga tayanish uchun 4 ta o'ziga xos primerdan foydalanadi, bunda zanjirli joy almashuvchi DNK sintezi uzluksiz ravishda o'z-o'zidan aylanadi.

Avval maqsadli genda 6 ta maxsus F3, F2, F1, B1, B2, B3 hududlarini aniqlang, so'ngra ushbu 6 ta maxsus mintaqa asosida 4 ta primerni loyihalashtiring (quyidagi rasmda ko'rsatilganidek):

Oldinga ichki astar (FIP) F1c va F2 dan iborat.

Orqaga qarab ichki astar (BIP) B1c va B2 dan iborat va TTTT o'rtada bo'shliq sifatida ishlatiladi.

F3 va B3 tashqi primerlari mos ravishda maqsadli gendagi F3 va B3 mintaqalaridan iborat.

LAMP reaktsiya tizimida ichki primerning konsentratsiyasi tashqi primerdan bir necha baravar yuqori.Ichki primer DNK qo'sh ipini hosil qilish uchun qo'shimcha ipni sintez qilish uchun avval shablon zanjiri bilan birlashtiriladi.Keyinchalik, tashqi primer DNK qo'sh ipini hosil qilish uchun shablon zanjiri bilan birlashtiriladi.BstDNK polimeraza ta'sirida ichki primer tomonidan sintez qilingan komplementar zanjir chiqariladi.Bir qator reaktsiyalardan so'ng, to'ldiruvchi zanjir nihoyat dumbbell tuzilishiga ega bo'lgan yagona DNK zanjirini hosil qiladi.

Dumbbell strukturasi DNKning bitta zanjirining o'zi doimiy ravishda ochiq uchi bo'lgan o'tish davri poyasi-pastali tuzilishi DNKni shakllantirish uchun shablon sifatida ishlatiladi.Ichki va tashqi primerlar o'tish davri poyasi-pastasi tuzilishi DNKni doimiy ravishda ipning siljishi va cho'zilishi reaktsiyalarini o'tkazishga yo'naltiradi va nihoyat turli uzunlikdagi bir nechta poya-pastadir tuzilmalarini hosil qiladi.DNK aralashmasi.

Loop vositasida izotermik kuchaytirishning afzalliklari va kamchiliklari

LAMP ning afzalliklari:

(1) 1 soat ichida maqsadli genning 1-10 nusxasini samarali ravishda kuchaytirishi mumkin bo'lgan yuqori kuchaytirish samaradorligi va kuchaytirish samaradorligi oddiy PCRdan 10-100 baravar yuqori.

(2) Reaktsiya vaqti qisqa, o'ziga xoslik kuchli va maxsus jihozlar talab qilinmaydi.

LAMPning kamchiliklari:

(1) Astarlar uchun talablar ayniqsa yuqori.

(2) Kuchaytirilgan mahsulotni klonlash va sekvensiyalash uchun ishlatish mumkin emas, lekin faqat hukm qilish uchun ishlatilishi mumkin.

(3) Kuchli sezuvchanligi tufayli aerozollar hosil bo'lishi oson, noto'g'ri ijobiy natijalarga olib keladi va sinov natijalariga ta'sir qiladi.

Strand almashinishini kuchaytirish

Iplarni siljitishni kuchaytirish (SDA) - birinchi marta 1992 yilda amerikalik olim Uoker tomonidan taklif qilingan fermentativ reaktsiyaga asoslangan in vitro izotermik DNKni kuchaytirish usuli.

SDA ning asosiy tizimi cheklovchi endonukleaza, zanjirning siljish faolligiga ega DNK polimeraza, ikki juft primer, dNTP, kaltsiy va magniy ionlari va bufer tizimlarini o'z ichiga oladi.

Iplarni siljishini kuchaytirish printsipi maqsadli DNKning ikkala uchida kimyoviy jihatdan o'zgartirilgan cheklash endonukleazasini tanib olish ketma-ketligiga asoslanadi.Endonukleaza DNK zanjiridagi bo'shliqni tanib olish joyida ochadi va DNK polimeraza bo'shliqni kengaytiradi 3' End va keyingi DNK zanjirini almashtiradi.

O'zgartirilgan DNKning bitta zanjirlari primerlar bilan birlashtirilishi va DNK polimeraza tomonidan qo'sh zanjirlarga kengaytirilishi mumkin.Ushbu jarayon doimiy ravishda takrorlanadi, shuning uchun maqsadli ketma-ketlik samarali ravishda kuchaytiriladi.

Iplarni siljitishni kuchaytirish texnologiyasining afzalliklari va kamchiliklari

SDA ning afzalliklari:

Kuchaytirish samaradorligi yuqori, reaktsiya vaqti qisqa, o'ziga xoslik kuchli va maxsus jihozlar talab qilinmaydi.

SDA ning kamchiliklari:

Mahsulotlar bir xil emas va ba'zi bir ipli va ikki qatorli mahsulotlar doimo SDA siklida ishlab chiqariladi va elektroforez bilan aniqlanganda muqarrar ravishda quyruq paydo bo'ladi.

Rolling doirasini kuchaytirish

Aylanma doirani kuchaytirish (RCA) patogen organizmlardan DNKni dumaloq doira orqali nusxalash usuliga asoslangan holda taklif etiladi.Bu doimiy haroratda shablon sifatida bir zanjirli dumaloq DNKdan foydalanishni nazarda tutadi va maxsus DNK polimeraza (masalan, Phi29) ) maqsadli genni kuchaytirishga erishish uchun aylana DNK sintezi ta'siri ostida.

RCA ni chiziqli kuchaytirish va eksponensial kuchaytirishga bo'lish mumkin.Chiziqli RCA samaradorligi 10 ga yetishi mumkin⁵marta va eksponent RCA samaradorligi 10 ga yetishi mumkin⁹marta.

Oddiy farqlash, quyidagi rasmda ko'rsatilganidek, chiziqli kuchaytirish a faqat 1 primerdan foydalanadi, eksponensial kuchaytirish b 2 primerga ega.

Lineer RCA, shuningdek, bitta primer RCA deb ham ataladi.Primer dumaloq DNK bilan bog'lanadi va DNK polimeraza ta'sirida kengaytiriladi.Mahsulot bitta halqa uzunligidan minglab marta ko'p sonli takrorlanuvchi ketma-ketliklarga ega bo'lgan chiziqli bitta ipdir.

Chiziqli RCA mahsuloti har doim boshlang'ich primerga ulanganligi sababli, signalni osongina aniqlash asosiy afzallikdir.

Eksponensial RCA, shuningdek Hyper shoxlangan kuchaytirish HRCA (Hyper tarmoqlangan RCA), eksponent RCA da, bitta primer RCA mahsulotini kuchaytiradi, ikkinchi primer RCA mahsuloti bilan gibridlanadi va uzayadi va almashtirish allaqachon RCA mahsulotiga bog'langan.

Nuklein kislotaning dumaloq doirasini kuchaytirishning afzalliklari va kamchiliklari

RCA ning afzalliklari:

Yuqori sezuvchanlik, yaxshi o'ziga xoslik va oson ishlash.

RCA ning kamchiliklari:

Signalni aniqlash paytida fon muammolari.RCA reaktsiyasi paytida aylanma qulflangan zond va bog'lanmagan zondning shablon DNK yoki RNK ba'zi fon signallarini yaratishi mumkin. 

Nukleiksidlar ketma-ketligiga asoslangan kuchaytirish

Nuklein kislotalar ketma-ketligiga asoslangan kuchaytirish (NASBA) - bu PCR asosida ishlab chiqilgan yangi texnologiya.Bu T7 promotor ketma-ketligi bilan bir juft primer tomonidan boshqariladigan doimiy va izotermik nuklein kislota kuchaytirilishi.Texnologiya shablon RNKni taxminan 2 soat ichida taxminan 109 marta kuchaytirishi mumkin, bu an'anaviy PCR usulidan 1000 baravar yuqori va maxsus jihozlarni talab qilmaydi.

Ushbu texnologiya kasalliklar paydo bo'lishi bilanoq tezkor tashxis qo'yish uchun qo'llanilgan va hozirda ko'plab kompaniyalar RNKni aniqlash to'plamlarida ushbu usuldan foydalanadilar.

RNK amplifikatsiyasi teskari transkripsiyali PCR texnologiyasidan ham foydalanishi mumkin bo'lsa-da, NASBA o'zining afzalliklariga ega: u nisbatan doimiy harorat sharoitida amalga oshirilishi mumkin va u an'anaviy PCR texnologiyasiga qaraganda ancha barqaror va aniqroqdir.

Reaksiya Selsiy bo‘yicha 41 daraja haroratda bo‘ladi va uni bajarish uchun AMV (qush mieloblastozi virusi) teskari transkriptaza, RNase H, T7 RNK polimeraza va bir juft primer kerak bo‘ladi.

Jarayon asosan quyidagilarni o'z ichiga oladi:

Oldinga primer T7 promouterining qo'shimcha ketma-ketligini o'z ichiga oladi.Reaktsiya jarayonida oldinga siljish RNK ​​zanjiri bilan bog'lanadi va DNK-RNK qo'sh zanjirini hosil qilish uchun AMV fermenti tomonidan katalizlanadi.

RNase H gibrid ikki zanjirdagi RNKni hazm qiladi va bir zanjirli DNKni saqlaydi.

Teskari primer va AMV fermenti ta'sirida T7 promotor ketma-ketligini o'z ichiga olgan DNK qo'sh zanjiri hosil bo'ladi.

T7 RNK polimeraza ta'sirida transkripsiya jarayoni tugallanadi va ko'p miqdorda maqsadli RNK ishlab chiqariladi.

NASBA afzalliklari:

(1) Uning primeri T7 promotor ketma-ketligiga ega, ammo xorijiy ikki zanjirli DNKda T7 promotor ketma-ketligi yo'q va uni kuchaytirib bo'lmaydi, shuning uchun bu texnologiya yuqori o'ziga xoslik va sezgirlikka ega.

(2) NASBA to'g'ridan-to'g'ri teskari transkripsiya jarayonini kuchaytiruvchi reaktsiyaga kiritib, reaktsiya vaqtini qisqartiradi.

NASBA ning kamchiliklari:

(1) Reaksiya komponentlari murakkabroq.

(2) Reaksiya narxini oshirish uchun uch xil ferment talab qilinadi.