Aniqlash texnologiyasi tarixidagi bir nechta inqilobiy ixtirolar mening fikrimcha, antigen-antikorga xos bog'lanish, PCR texnologiyasi va ketma-ketlik texnologiyasiga asoslangan immunobeling texnologiyasidir.Bugun biz PCR texnologiyasi haqida gapiramiz.PCR texnologiyasining evolyutsiyasiga ko'ra, odamlar odatda PCR texnologiyasini uch avlodga bo'lishadi: oddiy PCR texnologiyasi, real vaqtda floresan miqdoriy PCR texnologiyasi va raqamli PCR texnologiyasi.
Cumumiy PCR texnikasi
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
Kari Mullis 1983 yilda polimeraza zanjiri reaktsiyasini (polimeraza zanjiri reaktsiyasi, PCR) ixtiro qildi. Aytishlaricha, u qiz do'stini haydab ketayotganida birdan ilhomlanib, PCR printsipi (haydashning afzalliklari haqida) haqida o'ylagan.Kari Mullis 1993-yilda kimyo boʻyicha Nobel mukofotiga sazovor boʻldi. “Nyu-York Tayms” gazetasi shunday izoh berdi: “Juda oʻziga xos va ahamiyatli, biologiyani PCRdan oldingi va PCRdan keyingi davrlarga deyarli ajratadi.
PCR printsipi: DNK polimeraza katalizi ostida ona zanjir DNK shablon sifatida ishlatiladi va o'ziga xos primer kengaytmaning boshlang'ich nuqtasi sifatida ishlatiladi va ona zanjir shablonini to'ldiruvchi DNKning qiz zanjiri DNK denatürasyon, tavlanish, kengaytirish va boshqa bosqichlar orqali in vitro ko'chiriladi.Bu in vitro DNK sintezini kuchaytirish texnologiyasi bo'lib, u har qanday maqsadli DNKni in vitroda tez va maxsus kuchaytira oladi.
Oddiy PCR ning afzalliklari
1.Klassik usul, to'liq xalqaro va mahalliy standartlar
2.Asbob reagentlarining arzonligi
3.PCR mahsulotlarini boshqa molekulyar biologiya tajribalari uchun tiklash mumkin
Tavsiya etilgan Foregene PCR mashinasi: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Tegishli mahsulotlar: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Oddiy PCRning kamchiliklari
1.ifloslanishi oson
2.mashaqqatli operatsiya
3.faqat sifatli tahlil
4.O'rtacha sezuvchanlik
5.O'ziga xos bo'lmagan kuchaytirish mavjud va o'ziga xos bo'lmagan tarmoqli maqsadli tarmoqli bilan bir xil o'lchamda bo'lsa, uni ajratib bo'lmaydi.
Capillyar elektroforezga asoslangan PCR
Oddiy PCRning kamchiliklariga javoban, ba'zi ishlab chiqaruvchilar kapillyar elektroforez printsipiga asoslangan asboblarni taqdim etdilar.Kapillyarda PCR kuchaytirilishidan keyingi elektroforez bosqichi tugallanadi.Sezuvchanlik yuqoriroq va bir nechta bazalarning farqini ajratib ko'rsatish va kuchaytirishni MAERKER tomonidan hisoblash mumkin.mahsulot tarkibi.Kamchilik shundaki, PCR mahsuloti hali ham ochilishi va asbobga qo'yilishi kerak va hali ham katta ifloslanish xavfi mavjud.
CapillyarEelektroforez
2. Haqiqiy vaqtda floresan miqdoriy PCR (Quantitative Real-time PCR, qPCR) texnologiyasiFloresan miqdoriy PCR, shuningdek Real-Time PCR deb ham ataladi, bu 1995 yilda PE (Perkin Elmer) tomonidan ishlab chiqilgan yangi nuklein kislota miqdoriy texnologiyasidir. Floresan miqdoriy PCRning rivojlanish tarixi ABI, Roche va Bio-Rad kabi gigantlarning ruhni qo'zg'atuvchi kurashlari tarixidir.Agar qiziqsangiz, uni tekshirishingiz mumkin.Ushbu usul hozirda eng etuk va keng qo'llaniladigan yarim miqdoriy PCR usuli hisoblanadi.
Tavsiya etilgan qPCR mashinasi: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Floresan bo'yoq usuli (SYBR Green I):SYBR Green I kantitativ PCR uchun eng ko'p qo'llaniladigan DNK-bog'lovchi bo'yoq bo'lib, u ikki zanjirli DNKga xos bo'lmagan tarzda bog'lanadi.Erkin holatda SYBR Green zaif floresans chiqaradi, lekin bir marta ikki zanjirli DNK bilan bog'langandan so'ng, uning floresansi 1000 barobar ortadi.Shunday qilib, reaksiya natijasida chiqarilgan umumiy lyuminestsent signal mavjud bo'lgan ikki zanjirli DNK miqdoriga mutanosibdir va kuchaytirilgan mahsulotning ko'payishi bilan ortadi.Bo'yoq ikki zanjirli DNKga o'ziga xos bo'lmagan holda bog'langanligi sababli, noto'g'ri ijobiy natijalar paydo bo'lishi mumkin.
Tegishli mahsulotlar: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Floresan zond usuli (Taqman texnologiyasi): davomidaPCR amplifikatsiyasi, bir juft primer bilan bir vaqtning o'zida ma'lum bir floresan prob qo'shiladi.Zond chiziqli oligonukleotid bo'lib, har ikki uchida mos ravishda lyuminestsent muxbirlar guruhi va lyuminestsent o'chiruvchi guruh etiketlanadi.Prob buzilmagan bo'lsa, muxbir guruhi tomonidan chiqarilgan lyuminestsent signal söndürücü guruhi tomonidan so'riladi va aniqlash Floresan signali yo'q;PCR kuchaytirilishi paytida (kengayish bosqichida) Taq fermentining 5'-3' Diser faolligi probni hazm qiladi va degradatsiya qiladi, shuning uchun reportyor floresan guruhi va söndürme floresan guruhi ajratiladi, shuning uchun floresan monitoring tizimi lyuminestsent signalni olish mumkin bo'ladi, ya'ni har safar DNK zanjiri yoki grippning to'liq sintezini amalga oshiradi. lyuminestsent signallarning to'planishi va PCR mahsulotlarining shakllanishi.Taqman prob usuli klinik aniqlashda eng ko'p qo'llaniladigan aniqlash usuli hisoblanadi.
Tegishli mahsulotlar: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
qPCR ning afzalliklari
1.Usul etuk va qo'llab-quvvatlovchi uskunalar va reagentlar to'liq
2.Reaktivlarning o'rtacha narxi
3.foydalanish oson
4.Aniqlashning yuqori sezuvchanligi va o'ziga xosligi
qPCR ning kamchiliklari
Maqsadli genning mutatsiyasi o'tkazib yuborilgan aniqlashga olib keladi.
Past konsentratsiyali shablonni aniqlash natijasini aniqlab bo'lmaydi.
Miqdoriy aniqlash uchun standart egri chiziqdan foydalanishda katta xatolik mavjud.
3. Raqamli PCR (raqamli PCR, dPCR) texnologiyasi
Raqamli PCR - nuklein kislota molekulalarining mutlaq miqdorini aniqlash usuli.QPCR bilan solishtirganda, raqamli PCR to'g'ridan-to'g'ri DNK / RNK molekulalarining sonini o'qiy oladi, bu boshlang'ich namunadagi nuklein kislota molekulalarining mutlaq miqdoriy ko'rsatkichidir.1999 yilda Bert Vogelshteyn va Kennet V. Kin-zler rasman dPCR kontseptsiyasini taklif qilishdi.
2006 yilda Fluidigm birinchi bo'lib tijorat chipiga asoslangan dPCR asbobini ishlab chiqardi.2009 yilda Life Technologies OpenArray va QuantStudio 12K Flex dPCR tizimlarini ishga tushirdi.2013-yilda Life Technologies kompaniyasi QuantStudio 3DdPCR tizimini ishga tushirdi, u namunalarni 20 000 ta alohida hujayralarga teng taqsimlash uchun yuqori zichlikdagi nano-miqyosli mikrofluidik chip texnologiyasidan foydalanadi.reaksiyada yaxshi.
2011-yilda Bio-Rad tomchilarga asoslangan QX100 dPCR asbobini ishga tushirdi, u namunani 20 000 tomchi-moy-moyga teng taqsimlash uchun moydagi suv texnologiyasidan foydalanadi va tomchilarni tahlil qilish uchun tomchi analizatoridan foydalanadi.2012-yilda RainDance har bir standart reaksiya tizimini 1 milliondan 10 million pikolitr darajasidagi mikrotomchilarni o'z ichiga olgan reaksiya emulsiyasiga bo'lish uchun yuqori bosimli gaz bilan boshqariladigan RainDrop dPCR asbobini ishga tushirdi.
Hozirgacha raqamli PCR ikkita asosiy fraktsiyani, chip turi va tomchi turini tashkil etdi.Qanday raqamli PCR turi bo'lishidan qat'i nazar, uning asosiy tamoyillari suyultirish, so'nggi nuqta PCR va Puasson taqsimotini cheklashdir.Nuklein kislotasi shablonlarini o'z ichiga olgan standart PCR reaktsiya tizimi o'n minglab PCR reaktsiyalariga teng ravishda bo'linadi, ular chiplar yoki mikrotomchilarga taqsimlanadi, shuning uchun har bir reaktsiya imkon qadar ko'proq shablon molekulasini o'z ichiga oladi va bitta molekula shablonli PCR reaktsiyasi amalga oshiriladi.Floresansiyani o'qish orqali signalning mavjudligi yoki yo'qligi hisoblanadi va mutlaq miqdoriy aniqlash Puasson statistik taqsimotini kalibrlashdan keyin amalga oshiriladi.
Quyida men foydalangan bir nechta raqamli PCR platformalarining xususiyatlari keltirilgan:
1. Bio-Rad QX200 tomchi raqamli PCR Bio-RadQX200 - bu juda klassik raqamli PCR platformasi, asosiy aniqlash jarayoni: 20 000 ta namunalar tomchilar generatori tomonidan ishlab chiqariladi Yog'dagi suv mikro-tomchilari oddiy PCR mashinasida kuchaytiriladi va nihoyat, har bir mikro-tomchining floresans signali mikro-tomchi o'quvchi tomonidan o'qiladi.Operatsiya murakkabroq va ifloslanish xavfi o'rtacha.
Xinyi TD1 mikro-tomchi raqamli PCRXinyi TD1 mahalliy raqamli PCR platformasi bo'lib, asosiy aniqlash jarayoni: tomchilar generatori orqali 30 000-50 000 yog'dagi suv tomchilarini hosil qiladi, umumiy PCR asbobida kuchaytiradi va nihoyat o'tadi Tomchi o'quvchi har bir tomchining floresan signalini o'qiydi.Ushbu platformada tomchilar hosil qilish ham, o'qish ham ifloslanish xavfi past bo'lgan maxsus chipda amalga oshiriladi.
STILLA Naica mikro-tomchi chip raqamli PCRSTILLA Naica nisbatan yangi raqamli PCR platformasi.Asosiy aniqlash jarayoni: chipga reaktsiya eritmasini qo'shing, chipni mikro-tomchi hosil qilish va kuchaytirish tizimiga qo'ying va 30 000 mikro-tomchi hosil qiling.Chipga tarqaladi va chipda PCR kuchaytirilishi tugallanadi.Keyin kuchaytirilgan chip mikro-tomchi o'qishni tahlil qilish tizimiga o'tkaziladi va lyuminestsent signal suratga olish orqali o'qiladi.Butun jarayon yopiq chipda sodir bo'lganligi sababli, ifloslanish xavfi past bo'ladi.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D chipli raqamli PCR
ThermoFisher QuantStudio 3D yana bir klassik chipga asoslangan raqamli PCR platformasidir.Uning asosiy aniqlash jarayoni: reaktsiya eritmasini tarqatuvchiga qo'shing va reaksiya eritmasini tarqatuvchi orqali 20 000 mikroquyruq bilan chipga teng ravishda tarqating., kuchaytirish uchun chipni PCR mashinasiga qo'ying va nihoyat chipni o'quvchiga qo'ying va floresan signalni o'qish uchun suratga oling.Operatsiya nisbatan murakkab va butun jarayon yopiq chipda amalga oshiriladi va ifloslanish xavfi past.
5. JN MEDSYS Clarity chip raqamli PCR
JN MEDSYS Clarity - nisbatan yangi chip tipidagi raqamli PCR platformasi.Uning asosiy aniqlash jarayoni: reaksiya eritmasini aplikatorga qo'shing va reaksiya eritmasini aplikator orqali PCR trubkasiga o'rnatilgan 10 000 ta PCR trubasiga teng ravishda tarqating.Mikrog'ovakli chipda reaksiya eritmasi kapillyar ta'sir orqali chipga kiradi va chip bilan PCR trubkasi kuchaytirish uchun PCR mashinasiga joylashtiriladi va nihoyat chip fotoga olish orqali floresan signalni o'qish uchun o'quvchiga qo'yiladi.Operatsiya yanada murakkab.Kontaminatsiya xavfi past.
Har bir raqamli PCR platformasining parametrlari quyidagicha umumlashtiriladi:
Raqamli PCR platformasining baholash ko'rsatkichlari quyidagilardir: ajratilgan birliklar soni, lyuminestsent kanallar soni, ishning murakkabligi va ifloslanish xavfi.Lekin eng muhimi, aniqlashning aniqligi.Raqamli PCR platformalarini baholashning bir usuli - bir-birini tekshirish uchun bir nechta raqamli PCR platformalaridan foydalanish, boshqa yo'l esa aniq qiymatlarga ega standart moddalardan foydalanishdir.
dPCR ning afzalliklari
1.Mutlaq miqdorlashtirishga erishish
2.Yuqori sezuvchanlik va o'ziga xoslik
3.Kam nusxadagi namunalarni aniqlay oladi
dPCR ning kamchiliklari1. Qimmatbaho asbob-uskunalar va reagentlar 2. Murakkab operatsiya va uzoq aniqlash vaqti 3. Aniqlashning tor diapazoni
Hozirgi vaqtda PCR texnologiyasining uch avlodi o'zining afzalliklari va kamchiliklariga ega va ularning har biri o'z qo'llash sohalariga ega va bir avlod boshqasini almashtiradigan munosabatlar emas.Texnologiyaning uzluksiz rivojlanishi PCR texnologiyasiga yangi hayotiylikni kiritdi, bu uning birin-ketin dastur yo'nalishini ochishga imkon berdi, bu nuklein kislotani aniqlashni yanada qulay va aniqroq qilish imkonini berdi.
Manba: Doktor Yuan sizni sinovga olib boradi
Tavsiya etilgan mahsulotlar:
Yuborilgan vaqt: 2022 yil 18-noyabr
