RT-qPCR molekulyar biologiyaning asosiy tajribasi bo'lib, u bilan hamma tanish bo'lishi kerak.U asosan uchta bosqichni o'z ichiga oladi: RNK ekstraktsiyasi, cDNKga teskari transkripsiya va real vaqtda floresan miqdoriy PCR.Bu yordam bermaydi, nima bo'lyapti?Ehtimol, muammo borteskari transkripsiya tajribasi!Garchi teskari transkripsiya tajribasi faqat RNK, dNTP, primerlarni qo'shishi kerak bo'lsa ham.teskari transkriptazasantrifüj trubkasiga va yaxshilab aralashtiriladi, lekin haqiqiy ish jarayonida hali ham ko'p tafsilotlarga e'tibor berish kerak.Keling, bu haqda bilib olaylik!

RNK sifatini qanday baholash mumkin?
cDNK olish uchun RNK sifati juda muhim!RNK sifatini asosan ikki jihatdan aniqlash mumkin:
(1) RNK yaxlitligi:RNKning yaxlitligini agaroz gel elektroforezi yordamida tekshirish mumkin. Misol tariqasida eukariotlarni oladigan bo'lsak, to'liq umumiy RNK uchta aniq chiziqqa ega, molekulyar og'irliklar kattadan kichikgacha 28S, 18S va 5S, 28S esa 18S dan ikki baravar yorqinroq;agar uchta tasma ko'rinsa, lekin tarmoqli turi loyqa bo'lsa yoki Diffuziya RNKning qisman degradatsiyasini bildiradi.Ayni paytda, iltimos, teskari transkripsiya reaktsiyasini darhol bajaring va shablonni mos ravishda kiriting;agar faqat kichik molekulyar og'irlikdagi tasma ko'rinmasa yoki hech qanday tasma ko'rinmasa, RNK butunlay buzilgan va uni qayta ajratib olish kerak bo'ladi.Agilent 2100 tepalik diagrammasi va RIN qiymati bilan RNKning yaxlitligini ko'rsatadi.Agar nuklein kislota buzilmagan bo'lsa, elektroferogrammaning asosiy chizig'i tekis bo'ladi;agar nuklein kislota qattiq degradatsiyaga uchrasa, asosiy chiziq notekis bo'lib, ko'proq degradatsiya cho'qqilari paydo bo'ladi;RIN qiymati RNKning yaxlitligini aks ettiradi, 0-10 oralig'ida, qiymat qanchalik katta bo'lsa, RNK sifati shunchalik yaxshi bo'ladi.Xo'sh, to'liqlik darajasi qanchalik baland.
(2) RNKning tozaligi:OD260/280 nisbati UV spektrofotometriyasi bilan aniqlanishi mumkin.OD260/280 nisbati 1,9 dan 2,1 gacha bo'lsa, tozalik juda yaxshi.
Qoldiq genomik DNK noto'g'ri miqdoriy natijalarga olib kelishi mumkin
RNK ajratib olinganda, biz olgan RNK tozalanmagan genomik DNK (gDNK) bilan aralashishi mumkin.Shuning uchun teskari transkripsiyadan keyin cDNK ham aralashadigDNK.Pastki oqim davomidaqPCRreaktsiya,cDNKva gDNK bir vaqtning o'zida kuchaytirilishi mumkin, bu nisbatan kichik KT qiymatiga olib keladi, shuning uchun natijalar noto'g'ri bo'lishi mumkin.
Xo'sh, bu vaziyatda nima qilishimiz kerak?Foregenetaklif qiladi:
(1) teskari RNKda genomni tozalashni amalga oshiring, bu RNK ekstraktsiyasi paytida ustun ekstraktsiyasi bilan olib tashlanishi mumkin;
(2) Olingan RNKni DNase bilan davolashI , lekin uni EDTA bilan tugatish;
teskari transkripsiya reagentlarigenomni tozalash modullari bilan;

Teskari transkripsiya uchun primerlarni qanday tanlash mumkin?
Teskari transkripsiya primerlari teskari transkripsiya reaktsiyasining natijasiga ham ta'sir qiladi.Tajribaning o'ziga xos sharoitlariga ko'ra teskari transkripsiya uchun tasodifiy primerlarni, Oligo dT yoki genga xos primerlarni tanlashingiz mumkin:
(1) Maxsus transkriptlar: genga xos primerlar tavsiya etiladi;
(2) Uzoq parcha transkriptlari: Oligo dT/genga xos primerlar tavsiya etiladi;
(3) Uzoq segmentli transkriptlarning ichki qismlari: genga xos primerlar/ tasodifiy primerlar / tasodifiy primerlar + Oligo dT.Agar keyingi qPCR tajribasi amalga oshirilsa, Oligo dT dan yolg'iz foydalanish mumkin emas, chunki Oligo dT dan foydalanishning o'zi 3′ oxirigacha bo'lgan moyillikni keltirib chiqarishi mumkin, bu esa qPCR tajribasining noto'g'ri natijalariga olib keladi;
(4) miRNK: Stem-loop primerlari yoki tailing primerlari ishlatilishi mumkin.

Teskari transkripsiya mahsuloti cDNK miqdorini aniqlash uchun necha marta suyultirilishi kerak?
Teskari transkripsiya mahsulotining cDNKsini olgandan so'ng, qPCR tajribalari uchun cDNKni necha marta suyultirish kerakligi juda muhimdir.Agar cDNK kontsentratsiyasi juda yuqori yoki juda past bo'lsa, kuchaytirish samaradorligi ta'sir qilishi mumkin.cDNK kontsentratsiyasini o'lchash mumkinmi va buni qanday qilish kerak?
(1) Teskari transkripsiya mahsulotining cDNK kontsentratsiyasini o'lchash mumkin emas, chunki cDNA mahsulotiga qo'shimcha ravishda teskari transkripsiya mahsuloti teskari transkripsiya qoldig'i Bufer, teskari transkriptaza, primerlar va boshqalarni ham o'z ichiga oladi, bu konsentratsiyani o'lchash natijalariga xalaqit beradi va OD260/280 ni keltirib chiqaradi, shuning uchun OD260/280 ni aks ettirmaydi va abnormal nisbatni aks ettirmaydi.Bu vaqtda ba'zi do'stlar aytadilar, keyin tozalashdan keyin konsentratsiyani o'lchayman;Foregene shuni eslatib o'tmoqchiki, cDNKni tozalash tavsiya etilmaydi, chunki teskari yo'l bilan olingan cDNKning uzunligi boshqacha bo'lib, tozalashda qisqa cDNK yo'qoladi.
(2) Xo'sh, nima qilish kerak?qPCR tajribasidan oldin cDNK ning suyultirish gradienti oldingi tajriba orqali aniqlanishi mumkin.Misol uchun: qPCR tajribalari uchun shablon sifatida cDNK zaxira eritmasi, 10 marta suyultirish va 100 marta suyultirishdan foydalaning va 18-28 oralig'ida KT qiymati bilan suyultirish omilini tanlang.

MiRNKlarni qanday qilib teskari transkripsiya qilish kerak?
miRNK bir zanjirli kichik molekulali RNK bo'lib, o'lchami taxminan 22 nt bo'lib, oqsilni kodlamaydi.Qisqa uzunligi tufayli an'anaviy qPCR usuli uni to'g'ridan-to'g'ri aniqlash qiyin, shuning uchun ko'pincha miRNKni kengaytirish kerak bo'ladi;miRNK uchun tez-tez qo'llaniladigan teskari transkripsiya usullari o'z ichiga oladi ildiz-loop usuli va quyruq usuli.
Ip-loop usuli - bu ildiz-pastadir primerlarini qo'shish orqali miRNKni kengaytirish.Ushbu aniqlash usuli yuqori sezuvchanlik va o'ziga xoslikka ega, ammo aniqlash o'tkazuvchanligi past.Bitta teskari transkripsiya faqat bitta miRNK va ichki ma'lumotnomani aniqlay oladi;quyruq qo'shish usuli ikkitadan iborat U ikkita fermentning qo'shma harakati bilan yakunlanadi, ular PoliA polimeraza va teskari transkriptaza.PolyA polimeraza uzunligini oshirish uchun miRNKga PolyA quyruqlarini qo'shish uchun javobgardir va teskari transkriptaza teskari transkripsiya reaktsiyasini amalga oshiradi.Bu usul yuqori aniqlash qobiliyatiga ega va bir teskari transkripsiyada bir nechta miRNK va ichki havolalarni aniqlay oladi, ammo stend-loop usulida sezgirlik va o'ziga xoslik past.