PCR, bir nechta PCR, In situ PCR, Teskari PCR, RT-PCR, qPCR（1）-PCR

Biz turli xil PCR tushunchalarini, bosqichlarini va tafsilotlarini saralaymiz

Ⅰ. PCR

Polimeraza zanjiri reaktsiyasi, PCR deb ataladi, bu DNKning o'ziga xos qismlarini kattalashtirish uchun ishlatiladigan molekulyar biologik texnologiya.Uni in vitroda maxsus DNK replikatsiyasi deb hisoblash mumkin.DNK polimeraza (DNK polimeraza I) 1955 yilda kashf etilgan va E. Coli ning Klenow fragmenti, eksperimental ahamiyatga ega va amaliy ahamiyatga ega bo'lgan, 1970-yillarning boshlarida doktor H. Klenow tomonidan kashf etilgan, ammo bu ferment haroratga toqat qilmagani uchun yuqori harorat uni degeneratsiya qilishi mumkin, shuning uchun polimeraza degeneratsiyasi bilan yuqori harorat reaktsiyasiga javob bermaydi.Bugungi kunda qo'llaniladigan fermentlar (Taq polimeraza deb ataladi) 1976 yilda issiq buloq bakteriyasi Thermus aquaticusdan ajratilgan. Uning xarakteristikasi shundaki, u yuqori haroratga bardosh bera oladi va ideal ferment hisoblanadi, lekin u 1980-yillardan keyin keng qo'llanila boshlandi.PCR ning asl ibtidoiy prototipining asl kontseptsiyasi 1971 yilda doktor KJell Kleppe tomonidan taklif qilingan genlarni ta'mirlash va nusxalashga o'xshaydi. U birinchi oddiy va qisqa muddatli gen nusxasini nashr etdi (PZR ning dastlabki ikkita tsikli reaktsiyalariga o'xshash).Bugungi kunda ishlab chiqilgan PCR 1983 yilda doktor Kari B. Mullis tomonidan ishlab chiqilgan. Doktor Mullis o'sha yili PE kompaniyalariga xizmat qilgan, shuning uchun PE PCR sanoatida alohida maqomga ega.Doktor Mullis 1985 yilda Saiki va boshqalar bilan bog'liq bo'lgan birinchi maqolani rasman nashr etdi. O'shandan beri PCRdan foydalanish kuniga minglab kilometrlarni tashkil etadi va tegishli qog'ozlarning sifati ko'plab boshqa tadqiqot usullarini yoqimsiz qiladi, deyish mumkin.Keyinchalik, PCR texnologiyasi biologik ilmiy tadqiqotlar va klinik ilovalarda keng qo'llaniladi va molekulyar biologiya tadqiqotining eng muhim texnologiyasiga aylanadi.Mullis 1993 yilda kimyo bo'yicha Nobel mukofotiga sazovor bo'lgan.

PCRPrinsip

PCR texnologiyasining asosiy printsipi DNKning tabiiy replikatsiya jarayoniga o'xshaydi va uning o'ziga xosligi maqsadli ketma-ketlikning ikkala uchini to'ldiruvchi oligonükleotid primeriga bog'liq.PCR degeneratsiya-tavlanish-uzaytiruvchi uchta asosiy reaksiya bosqichidan iborat: ①DNK shablonining degeneratsiyasi: Shablon DNK ma'lum vaqt davomida taxminan 93°C ga qadar qizdirilgandan so'ng, PCR qo'shilishi natijasida hosil bo'lgan qo'sh zanjirli DNK uchun qo'sh DNK eritmasi shablonni DNKning keyingi qatlamlash jarayoniga tayyorlanishi uchun uni yagona zanjirga tayyorlashi mumkin. dumaloq reaktsiya.②Shablon DNK va primerning tavlanishi (birikmasi): Shablon DNK qizdirilgandan va bitta zanjirga degeneratsiya qilingandan so'ng, harorat taxminan 55 ° C ga tushadi.Primer va shablon DNKning bir-birini to'ldiruvchi ketma-ketligi.③Primerning kengaytmasi: DNK shablon - primer bog'lanishi TaqDNK polimeraza ta'siriga asoslangan bo'lib, reaksiya xom ashyosi sifatida dNTP.Replikatsiya printsipini saqlang, shablon DNK zanjirini to'ldiruvchi yangi yarim zahiralangan nusxa zanjirini sintez qiling va takroriy tsikl degeneratsiya-tavlanish-kengaytirish uchta jarayon ko'proq "yarim zahiralangan nusxa ko'chirish zanjiri" ni olishi mumkin va bu yangi zanjir yana mavjud Keyingi sikl uchun shablonga aylaning.Loopni bajarish uchun 2-4 daqiqa kerak bo'ladi, maqsadli gen 2-3 soat ichida bir necha million marta kuchaytirilishi mumkin.

StandartPCRReaktsiya tizimi

PCR reaktsiyasining beshta elementi

PCR reaktsiyasida asosan besh turdagi moddalar ishtirok etadi, ya'ni primer, ferment, dNTP, shablon va bufer (Mg2+ kerak).[PCR protsedurasi]

Standart PCR jarayoni uch bosqichga bo'lingan

1. DNK degeneratsiyasi (90°C-96°C): Ikki zanjirli DNK shablonlari termal ta'sir ostida, vodorod aloqalari uzilib, bitta zanjirli DNK hosil qiladi.

2. Yuvish (25 ℃ -65 ℃): Tizim harorati pasayadi, primer mahalliy ikki zanjir hosil qilish uchun DNK shabloni bilan birlashtiriladi.

3. Kengaytma (70 ℃ -75 ℃): Taq fermenti ta'sirida (taxminan 72 ° C, eng yaxshi faollik), dNTP xom ashyo sifatida ishlatiladi, primerning 5' uchidan → 3' uchidan cho'ziladi, sintez va shablon bir-birini DNK zanjiri bilan to'ldiradi.

Har bir tsikl denatüratsiya qilinadi, tavlanadi va kengaytiriladi, DNK tarkibini ikki baravar oshiradi.Hozirgi vaqtda qisqa amplifikatsiya maydoni tufayli, Taq fermenti faolligi optimal bo'lmasa ham, ba'zi PCR juda qisqa vaqt ichida takrorlanishi mumkin, shuning uchun uni ikki bosqichga o'zgartirish mumkin, ya'ni tavlanish va kengaytirish bir vaqtning o'zida 60 ° C-65 ° C da amalga oshirilishi mumkin.Ko'tarish va sovutish jarayonini kamaytirish va javob tezligini yaxshilash uchun.

PCR reaktsiyasining xususiyatlari

● Yuqori aniqlik

PCR javobining o'ziga xos hal qiluvchi omillari quyidagilardir: ① Primer va shablon DNKning o'ziga xos kombinatsiyasi.②Asosiy juftlik printsipi.③TaqDNK polimeraza sintez reaktsiyasining sodiqligi.④Maqsadli genning o'ziga xosligi va konservativligi.

Astarlar va shablonlarning to'g'ri kombinatsiyasi kalit hisoblanadi.Astar va shablonni bog'lash va astar zanjirining kengayishi ishqoriy asosni moslashtirish printsipiga asoslanadi.Polimeraza sintez reaktsiyalarining sodiqligi va Taq DNK polimerazasining yuqori haroratga chidamliligi reaktsiyada shablon va primerning bog'lanishini (birikmasini) yuqori haroratda bajarish mumkin.Kombinatsiyaning o'ziga xosligi sezilarli darajada oshadi.Klip yuqori darajadagi to'g'rilikni saqlab turishi mumkin.Yuqori konservativlik va yuqori konservativlik bilan maqsadli genetik hududni tanlab, uning o'ziga xosligi yuqoriroq bo'ladi.

● Yuqori sezuvchanlik

PCR mahsulotlarini ishlab chiqarish hajmi indeks bo'yicha oshiriladi, bu mikrokontroller darajasini mikrogramlar (mkg = -6) darajasiga oshirish uchun Pickerning boshlang'ich shablonini (PG=10-12) kengaytirishi mumkin.1 million hujayradan maqsadli hujayralar aniqlanishi mumkin;viruslarni aniqlashda PCRning sezgirligi 3 RFU ga yetishi mumkin (bo'sh joylar hosil bo'lgan birliklar);bakterial fanda minimal aniqlash darajasi 3 bakteriya.

● Oddiy va tez

PCR aks ettirishda yuqori haroratli Taq DNK polimeraza ishlatiladi, u bir vaqtning o'zida reaktsiya eritmasini qo'shadi, ya'ni DNKni kuchaytirish eritmasi va suv hammomida degeneratsiya-anneal-kengayish reaktsiyasi.Odatda, kuchaytirish reaktsiyasi 2-4 soat ichida tugaydi.Kengaytirilgan mahsulotlar odatda elektr qilich bilan tahlil qilinadi va izotoplardan foydalanish shart emas, radioaktiv ifloslanish yo'q va oson reklama.

● Namunaning tozaligi past

Viruslar yoki bakteriyalar va madaniyat hujayralarini ajratishning hojati yo'q.DNK xom ashyolari va RNK kuchaytirgich sifatida ishlatilishi mumkin.DNK kuchaytirilishini aniqlash qon, tana suyuqligi, yo'talni yuvish suyuqligi, sochlar, hujayralar va tirik to'qimalar kabi klinik namunalar yordamida bevosita ishlatilishi mumkin.

PCRumumiy muammolar

● Noto'g'ri salbiy, kuchaytirilgan bantlar yo'q

PCR reaktsiyasining asosiy bosqichlari quyidagilardan iborat: ① shablon nuklein kislotalarni tayyorlash, ② primerlarning sifati va o'ziga xosligi, ③ fermentlarning sifati ④ PCR siklining shartlari.Sababini topish yuqoridagi havolalar uchun ham tahlil qilinishi va o'rganilishi kerak.

Shablonlar: ① Shablon turli xil oqsillarni o'z ichiga oladi, ② Shablonda Taq fermenti inhibitori mavjud, ③ Shablondagi oqsil, ayniqsa xromosomadagi guruh oqsili yo'q qilinmaydi.⑤ Deminer nuklein kislotasi degeneratsiyasi to'liq emas.Fermentlar va primerlarning sifati yaxshi bo'lganda, kuchaytiruvchi tasma yo'q, bu katta ehtimollik bilan namunalarni hazm qilish jarayonidir.Shablon nuklein kislotasini olish jarayonida noto'g'ri narsa bor, shuning uchun samarali va barqaror hazm qilish eritmasini tayyorlash uchun uning tartibi o'rnatilishi va o'zboshimchalik bilan o'zgartirilmasligi kerak.

Fermentning inaktivatsiyasi: yangi ferment yoki eski va yangi fermentlar ferment faolligi yo'qolgan yoki etarli emasligini tahlil qilish uchun birgalikda ishlatilishi kerak, bu noto'g'ri salbiylarga olib keladi.Shuni ta'kidlash kerakki, Taq fermenti yoki etidium bromidi ba'zan unutiladi.

Primer: astarning sifati, astar konsentratsiyasi va ikkita astarning konsentratsiyasi nosimmetrik bo'ladimi.Bu PCR etishmovchiligining umumiy sababi yoki ortib borayotgan band ideal emas va tarqalishga moyil.Ba'zi partiya raqamlari astarlarining sifati bilan bog'liq muammolar mavjud.Ikki primer yuqori konsentratsiyali va past konsentratsiyaga ega bo'lib, past samaradorlik assimetrik kuchaytirilishiga olib keladi.Qarshi choralar quyidagilardir: ① Birliklarni sintez qilish uchun yaxshi primerni tanlang.② Primer konsentratsiyasi nafaqat OD qiymatiga bog'liq, balki agar shakar jeli elektroforezini qilish uchun primerning asl suyuqligiga ham e'tibor beradi.Belt, PCR bu vaqtda muvaffaqiyatsiz bo'lishi mumkin va uni primer sintez birligi bilan hal qilish kerak.③ Sovutgichning bir nechta muzlashi yoki uzoq muddatli sovutgich qismlarining oldini olish uchun primer to'lanishi va yuqori konsentratsiyada saqlanishi kerak, bu esa astarning yomonlashishiga va buzilishiga olib keladi.④ Astarning dizayni asossiz, masalan, astar uzunligi etarli emas va primerlar orasida di klaster hosil bo'ladi.

Mg2 + kontsentratsiyasi: Mg2 + ion kontsentratsiyasi PCR kuchaytirish samaradorligiga katta ta'sir ko'rsatadi.Haddan tashqari kontsentratsiya PCR kuchaytirilishining qarama-qarshi jinsini kamaytirishi mumkin.Agar kontsentratsiya juda past bo'lsa, PCR kuchaytirish chiqishi hatto kengaytirish diapazonisiz PCR kuchaytirilishini muvaffaqiyatsizlikka olib keladi.

Reaksiya hajmining o'zgarishi: PCR kuchaytirilishida ishlatiladigan hajm 20ul, 30ul va 50ul yoki 100uL, PCR kuchaytirish uchun arizaning katta hajmi ilmiy tadqiqot va klinik sinovlarning turli maqsadlariga muvofiq belgilanadi.20ul kabi kichik hajmlarni qilgandan so'ng, o'lchamni qilishda shnur holatini qilish kerak, aks holda u muvaffaqiyatsiz bo'ladi.

Jismoniy sabablar: Transformatsiya PCR kuchaytirilishi uchun juda muhimdir.Agar degeneratsiya harorati past bo'lsa, degeneratsiya vaqti qisqa bo'lsa, u noto'g'ri salbiylarda paydo bo'lishi mumkin;juda past tavlanish harorati o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirishga olib kelishi va o'ziga xos kuchaytirish samaradorligini kamaytirishi mumkin.PCR kuchaytirish samaradorligini pasaytirish uchun primerlar va shablonlarning kombinatsiyasiga yuqori darajada ta'sir qiladi.Ba'zan u PCR ishlamay sabablaridan biri hisoblanadi uzatma yoki suvda eruvchan pishirgich, o'zgaruvchanlik, tavlama va kengaytirilgan harorat aniqlash uchun standart termometr foydalanish kerak bo'ladi.

Maqsadli ketma-ketlik variantlari: Agar maqsadli ketma-ketlik, mutatsiya yoki o'chirish sodir bo'lsa, prototip va shablon kombinatsiyasi birlashtirilsa yoki maqsad ketma-ketligi yo'qligi sababli, primer va shablon qo'shimcha ketma-ketlikni yo'qotadi va uning PCR kuchaytirilishi muvaffaqiyatli bo'lmaydi.

● Noto'g'ri ijobiy

PCR kuchaytirish diapazoni maqsadli ketma-ketlik bandiga mos keladi va ba'zida uning bandi yanada toza va balandroq bo'ladi.

Primer dizayni mos emas: tanlangan kuchaytirish ketma-ketligi va maqsadli bo'lmagan kuchaytirish ketma-ketligi gomologik xususiyatga ega, shuning uchun PCR kuchaytirilganda kuchaytirilgan PCR mahsulotlari maqsadli bo'lmagan ketma-ketliklardir.Qayta loyihalash kerak.

Maqsadli ketma-ketlik yoki kuchaytiruvchi mahsulotlarning o'zaro ifloslanishi: Bu ifloslanishning ikkita sababi bor: Birinchidan, butun genomning yoki katta segmentlarning o'zaro ifloslanishi, noto'g'ri musbatlarga olib keladi.Ushbu turdagi noto'g'ri musbatni quyidagi usullar bilan hal qilish mumkin: Ishlayotganda ehtiyotkorlik va muloyim bo'ling, maqsad ketma-ketligi namuna tabancasiga nafas olmasligi yoki markazdan qochma trubkadan sachramasligi uchun.Ikkinchidan, havo ifloslanishida kichik bo'laklar.Uni bir-biriga yopishtirish mumkin.

● Nonspesifik kuchaytirish diapazoni paydo bo'ladi

PCR kuchaytirilishidan keyin paydo bo'lgan bantlar kutilgan o'lchamga yoki katta yoki kichik, yoki bir vaqtning o'zida yoki bir vaqtning o'zida o'ziga xos kuchaytirish bantlari va o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirish bantlariga mos kelmaydi.O'ziga xos bo'lmagan bantlarning paydo bo'lishi: Birinchidan, primerlar maqsadli ketma-ketlikni to'liq to'ldirmaydi yoki di klasterni hosil qilish uchun primerning polimerizatsiyasi.Ikkinchisi, MG2 + ionlarining kontsentratsiyasi juda yuqori, tavlanish harorati juda past va PCR davrlari soni bog'liq.Ikkinchidan, fermentlarning sifati va miqdori.Ko'pincha, ba'zi manbalarning fermentlari maxsus bo'lmagan chiziqlarga moyil bo'lib, boshqa manbaning fermentlari paydo bo'lmaydi.Ba'zida fermentlarning o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirilishi ham sodir bo'ladi.Qarshi choralar quyidagilardan iborat: agar kerak bo'lsa, diqqatga sazovor joylarni qayta loyihalash.Ferment miqdorini kamaytiring yoki boshqa manbaning fermentini almashtiring.Birlamchi miqdorni kamaytiring, shablonlar miqdorini mos ravishda oshiring va tsikllar sonini kamaytiring.Yuvish haroratini to'g'ri oshiring yoki ikkita harorat nuqtasi usulini qo'llang (93 ° C degeneratsiya, tavlanish va taxminan 65 ° C da cho'zish).

● Qopqoq yoki smear lentasi paydo bo'ladi

Sababi, fermentlarning ortiqcha miqdori yoki fermentning sifatsizligi tufayli dNTP kontsentratsiyasi juda yuqori, Mg2 + kontsentratsiyasi juda yuqori, tavlanish harorati juda past va tsikllar soni juda ko'p.

Tegishli mahsulotlar

PCR Heroᵀᴹ (bo'yoq bilan)

◮ Tezroq kuchaytirish tezligi

◮ Shablonga ko'proq moslashish

◮ Yuqori kuchaytirish samaradorligi

◮ U 5'→3' DNK polimeraza faolligi va 5'→3' ekzonukleaza faolligiga ega, 3'→5' eksonukleaza faolligisiz.

PCR Easyᵀᴹ (bo'yoq bilan)

Noyob reaktsiya tizimi va yuqori samarali Taq DNK polimeraza PCR reaktsiyasini yuqori kuchaytirish samaradorligi, o'ziga xosligi va sezgirligiga ega qiladi.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Bir qadam)-SYBR Green I

◮ Bir bosqichli to'plam bir xil naychada teskari transkripsiya va qPCR ikkita reaktsiyani amalga oshiradi, faqat shablon RNK, maxsus PCR primerlari va RNase-Free ddH qo'shish kerak.₂O.

◮ To'plamda noyob Foregene teskari transkripsiya reagenti va Foregene HotStar Taq DNK polimerazasi noyob reaktsiya tizimi bilan birgalikda kuchaytirilishi samaradorligi va reaktsiyaning o'ziga xosligini samarali yaxshilash uchun foydalanadi.

◮ Optimallashtirilgan reaksiya tizimi reaksiyani yuqori sezuvchanlik, kuchli termal barqarorlik va yaxshi bardoshlik bilan ta'minlaydi.

◮ RT-qPCR oson^TM(Bir qadam)-SYBR Green I to'plami ROX ichki mos yozuvlar bo'yog'i bilan birga keladi, bu signal fonini va quduqlar orasidagi signal xatolarini bartaraf etish uchun ishlatilishi mumkin, bu mijozlar uchun turli xil miqdoriy PCR asboblarida foydalanish uchun qulaydir.

RT oson^TMII (Master Premiks uchun uchun birinchi zanjirli cDNK sinteziReal Time PCR)

- 2 daqiqa ichida shablondagi gDNKni olib tashlashi mumkin bo'lgan gDNKni olib tashlashning samarali qobiliyati.

- Samarali teskari transkripsiya tizimi, cDNKning birinchi zanjiri sintezini yakunlash uchun atigi 15 daqiqa vaqt ketadi.

-Murakkab shablonlar: yuqori GC tarkibiga va murakkab ikkilamchi tuzilishga ega shablonlarni ham yuqori samaradorlik bilan qaytarish mumkin.

-Yuqori sezgir teskari transkripsiya tizimi, pg-darajali shablonlar ham yuqori sifatli cDNKni olishi mumkin.

- Teskari transkripsiya tizimi yuqori termal barqarorlikka ega, optimal reaktsiya harorati 42 ℃ va u hali ham 50 ℃ da yaxshi teskari transkripsiyaga ega.