PCR (polimeraza zanjiri reaktsiyasi) 30 yildan ortiq tarixga ega bo'lgan in-vitro DNKni kuchaytirish texnologiyalaridan biridir.

PCR texnologiyasi 1983 yilda AQSHning Ketus shahridan Kari Mullis tomonidan kashshof bo'lgan. Mullis 1985 yilda PCR patentiga murojaat qilgan va o'sha yili Fan bo'yicha birinchi PCR akademik maqolasini nashr etgan.Mullis 1993 yilda kimyo bo'yicha Nobel mukofotiga sazovor bo'lgan.

PCRning asosiy tamoyillari

PCR maqsadli DNK fragmentlarini bir million martadan ko'proq oshirishi mumkin.Printsip DNK polimeraza katalizi ostida bo'lib, asosiy DNKni shablon sifatida va o'ziga xos primerni kengaytirish uchun boshlang'ich nuqta sifatida ishlatadi.U in vitro denaturatsiya, tavlanish va kengaytirish kabi bosqichlar orqali takrorlanadi.DNKning asosiy zanjir shablonini to'ldiruvchi qiz zanjiri DNK jarayoni.

Standart PCR jarayoni uch bosqichga bo'lingan:

1.Denaturatsiya: DNK juft iplarini ajratish uchun yuqori haroratdan foydalaning.DNK juft zanjirlari orasidagi vodorod aloqasi yuqori haroratda (93-98 ℃) buziladi.

2.Annealing: Ikki zanjirli DNK ajratilgandan so'ng, primer bir ipli DNK bilan bog'lanishi uchun haroratni pasaytiring.

3.Kengaytma: DNK polimeraza harorat tushirilganda bog'langan primerlardan DNK iplari bo'ylab komplementar iplarni sintez qila boshlaydi.Kengaytma tugagach, tsikl tugallanadi va DNK fragmentlari soni ikki barobar ortadi

Ushbu uch bosqichni 25-35 marta takrorlash, DNK fragmentlari soni eksponent ravishda oshadi.

PCRning zukkoligi shundaki, turli xil primerlar turli maqsadli genlar uchun mo'ljallangan bo'lishi mumkin, shuning uchun maqsadli gen fragmentlari qisqa vaqt ichida kuchaytirilishi mumkin.

Hozirgacha PCRni uchta toifaga bo'lish mumkin, ya'ni oddiy PCR, floresan miqdoriy PCR va raqamli PCR.

Oddiy PCRning birinchi avlodi

Maqsadli genni kuchaytirish uchun oddiy PCR kuchaytiruvchi asbobdan foydalaning va keyin mahsulotni aniqlash uchun agaroz jel elektroforezidan foydalaning, faqat sifatli tahlil qilish mumkin.

Birinchi avlod PCR ning asosiy kamchiliklari:

1.Spesifik bo'lmagan kuchaytirish va noto'g'ri ijobiy natijalarga moyil.

2.Aniqlash uzoq vaqt talab etadi va operatsiya mashaqqatli.

3.Faqat sifatli test amalga oshirilishi mumkin

Ikkinchi avlod Real-Time PCR

Real-Time PCR, shuningdek, qPCR sifatida ham tanilgan, reaktsiya tizimining borishini ko'rsatadigan floresan zondlardan foydalanadi va floresan signallarining to'planishi orqali kuchaytirilgan mahsulotlarning to'planishini nazorat qiladi va natijalarni floresan egri chizig'i orqali baholaydi.Uning miqdorini Cq qiymati va standart egri chiziq yordamida aniqlash mumkin.

qPCR texnologiyasi yopiq tizimda amalga oshirilganligi sababli, ifloslanish ehtimoli kamayadi va floresan signal miqdoriy aniqlash uchun kuzatilishi mumkin, shuning uchun u klinik amaliyotda eng ko'p qo'llaniladi va PCRda dominant texnologiyaga aylandi.

Haqiqiy vaqtda lyuminestsent miqdoriy PCRda ishlatiladigan floresan moddalarni quyidagilarga bo'lish mumkin: TaqMan floresan probi, molekulyar mayoqlar va floresan bo'yoq.

1) TaqMan lyuminestsent probi:

PCR amplifikatsiyasi paytida, bir juft primer qo'shilganda, maxsus floresan prob qo'shiladi.Zond oligonukleotid bo'lib, ikkala uchi muxbir floresan guruhi va söndürücü floresan guruhi bilan etiketlanadi.

Prob buzilmagan bo'lsa, muxbirlar guruhi tomonidan chiqarilgan floresan signal söndürme guruhi tomonidan so'riladi;PCR kuchaytirilishi paytida Taq fermentining 5'-3' eksonukleaza faolligi zondni parchalaydi va degradatsiya qiladi, bu esa lyuminestsent guruhini va so'ndiruvchini qiladi. signal PCR mahsulotining shakllanishi bilan to'liq sinxronlashtiriladi.

2) SYBR lyuminestsent bo'yoq:

PCR reaktsiya tizimida ortiqcha SYBR floresan bo'yoq qo'shiladi.SYBR lyuminestsent bo'yog'i o'ziga xos bo'lmagan holda DNKning qo'sh zanjiriga kiritilgandan so'ng, u flüoresan signal chiqaradi.Zanjirga kiritilmagan SYBR bo'yoq molekulasi hech qanday lyuminestsent signalni chiqarmaydi, shu bilan floresan signalni ta'minlaydi PCR mahsulotlarining ko'payishi PCR mahsulotlarining ko'payishi bilan to'liq sinxronlashtiriladi.SYBR faqat ikki zanjirli DNK bilan bog'lanadi, shuning uchun erish egri PCR reaktsiyasining o'ziga xosligini aniqlash uchun ishlatilishi mumkin.

3) Molekulyar mayoq:

Bu 5 va 3 uchlarida taxminan 8 ta asosdan iborat soch tolasi tuzilishini tashkil etuvchi ikki tomonlama yorliqli oligonükleotid zondi.Ikkala uchidagi nuklein kislota ketma-ketligi bir-birini to'ldiruvchi tarzda juftlanadi, bu esa floresan guruhi va söndürme guruhining qattiq bo'lishiga olib keladi.Yopiq, floresan hosil bo'lmaydi.

PCR mahsuloti ishlab chiqarilgandan so'ng, yumshatish jarayonida molekulyar mayoqning o'rta qismi ma'lum bir DNK ketma-ketligi bilan bog'lanadi va floresan gen floresan hosil qilish uchun söndürme genidan ajratiladi.

Ikkinchi avlod PCR ning asosiy kamchiliklari:

Hali sezgirlik yo'q va kam nusxadagi namunalarni aniqlash noto'g'ri.

Fon qiymatining ta'siri mavjud va natija shovqinga moyil.

Reaksiya tizimida PCR inhibitörleri mavjud bo'lganda, aniqlash natijalari shovqinga moyil bo'ladi.

Uchinchi avlod raqamli PCR

Raqamli PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) oxirgi nuqtani aniqlash orqali maqsadli ketma-ketlikning nusxasi raqamini hisoblab chiqadi va ichki nazorat va standart egri chiziqlardan foydalanmasdan aniq mutlaq miqdoriy aniqlashni amalga oshirishi mumkin.

Raqamli PCR yakuniy nuqtani aniqlashdan foydalanadi va Ct qiymatiga (tsikl chegarasi) bog'liq emas, shuning uchun raqamli PCR reaktsiyasi kuchaytirish samaradorligidan kamroq ta'sirlanadi va PCR reaktsiyasi ingibitorlariga nisbatan bardoshlik yaxshilanadi, yuqori aniqlik va takrorlanishi mumkin.

Yuqori sezuvchanlik va yuqori aniqlik xususiyatlariga ko'ra, u PCR reaktsiyasi inhibitörleri tomonidan osonlikcha aralashmaydi va tadqiqot va dastur nuqtasiga aylangan standart mahsulotlarsiz haqiqiy mutlaq miqdorni aniqlashga erisha oladi.

Reaksiya birligining turli shakllariga ko'ra, uni uchta asosiy turga bo'lish mumkin: mikrosuyuqlik, chip va tomchi tizimlar.

1) Mikrofluidik raqamli PCR, mdPCR:

Mikrofluidik texnologiyaga asoslanib, DNK shabloni ajratiladi.Mikrofluidik texnologiya namunani nano-yangilashni yoki kichikroq tomchilarni hosil qilishni amalga oshirishi mumkin, ammo tomchilar maxsus adsorbsiya usuliga muhtoj va keyin PCR reaktsiya tizimi bilan birlashtiriladi.mdPCR asta-sekin boshqa usullar bilan almashtirildi.

2) Tomchilarga asoslangan raqamli PCR, ddPCR:

Namunani tomchilarga qayta ishlash uchun yog'dagi suv tomchilarini hosil qilish texnologiyasidan foydalaning va nuklein kislota molekulalarini o'z ichiga olgan reaktsiya tizimini minglab nano o'lchamli tomchilarga bo'ling, ularning har birida aniqlanishi kerak bo'lgan nuklein kislotasi maqsadli molekulasi mavjud emas yoki bir yoki bir nechta nuklein kislotasi maqsadli molekulalarini o'z ichiga oladi.

3) Chipga asoslangan raqamli PCR, cdPCR:

Kremniy gofretlari yoki kvarts oynalarida ko'plab mikrotubalar va mikrokavitlarni o'yib chiqarish va turli xil nazorat klapanlari orqali eritma oqimini nazorat qilish va mutlaq miqdoriy aniqlashga erishish uchun namunali suyuqlikni raqamli PCR reaktsiyasi uchun reaktsiya quduqlariga bir xil o'lchamdagi nanometrlarga bo'lish uchun integratsiyalangan suyuqlik yo'li texnologiyasidan foydalaning.

Uchinchi avlod PCR ning asosiy kamchiliklari:

Uskunalar va reagentlar qimmat.

Shablon sifatiga talablar yuqori.Agar shablon miqdori mikrotizim miqdoridan oshsa, miqdorni aniqlash mumkin bo'lmaydi, agar u juda kichik bo'lsa, miqdoriy aniqlashning aniqligi pasayadi.

Nomaxsus kuchaytirish mavjud bo'lganda ham noto'g'ri musbat hosil bo'lishi mumkin.