COVID-19 - bu og'ir o'tkir respirator sindromli 2-toifa Koronavirus sabab bo'lgan yuqumli kasallik. Odam infektsiyalanganida, eng ko'p uchraydigan alomatlarga isitma, yo'tal va nafas qisilishi kiradi.

Sinov uchun ishlatiladigan namunalar nazofarengeal tamponlar yoki orofaringeal tamponlar bilan to'planishi mumkin.

PCR nima?

Koronavirusni aniqlashning standart usuli bu polimeraza zanjiri reaktsiyasi, PCR.Bu molekulyar biologiyada keng qo'llaniladigan usul.U tezda millionlab milliardlab o'ziga xos DNK parchalarini nusxalashi mumkin.

Yangi koronavirus juda uzun bir zanjirli RNK genomiga ega.Ushbu viruslarni PCR orqali aniqlash uchun RNK molekulalari teskari transkriptaza orqali ularning to'ldiruvchi DNK ketma-ketligiga aylantirilishi kerak, so'ngra yangi sintezlangan DNK odatda RT-PCR deb nomlanuvchi standart PCR protseduralari bilan kuchaytirilishi mumkin.

RT-PCR jarayoni

RNK ekstraktsiyasi

Ushbu usulni amalga oshirish uchun virusli RNK asosan ekstrakte qilinishi kerak.Qulay, tez va samarali ajratish uchun turli xil RNK tozalash to'plamlaridan foydalanish mumkin.

Tijoriy to'plam yordamida virusli RNKni ajratib olish uchun avval namunani mikrotsentrifuga trubasiga qo'shing va keyin uni lizis buferi bilan aralashtiring.Bu tampon yuqori darajada denatüratsiyalangan va odatda fenol va guanidin izotiosiyanatdan iborat.Bundan tashqari, RNaz inhibitörleri odatda buzilmagan virusli RNK izolyatsiyasini ta'minlash uchun lizis buferida mavjud.

Lizis buferini qo'shgandan so'ng, aralashtirish trubkasini puls bilan aylantiring va xona haroratida inkubatsiya qiling.Keyin virus lizis buferi tomonidan ta'minlangan yuqori denaturatsiyali sharoitlarda lizislanadi.

Namuna lizislangandan so'ng, tozalash jarayoni uchun santrifüj trubkasi ishlatiladi.Namuna santrifüj trubasiga yuklanadi va keyin santrifüjlanadi.

Ushbu protsedura qattiq fazali ekstraktsiya usuli bo'lib, unda statsionar faza silika jeli matritsasidan iborat.

Optimal tuz va pH sharoitida RNK molekulalari silika membranasiga bog'lanadi.

Shu bilan birga, oqsil va boshqa ifloslantiruvchi moddalar chiqariladi.

Santrifüjdan so'ng, santrifuga trubkasini toza yig'ish trubasiga soling, filtratni tashlang va keyin yuvish buferini qo'shing.

Yuvish tamponini membranadan o'tkazish uchun naychani yana santrifugaga joylashtiring.Bu membranadan qolgan barcha aralashmalarni olib tashlaydi va faqat silikagel bilan bog'langan RNKni qoldiradi.

Namuna yuvilgandan so'ng, trubkani toza mikrotsentrifuga trubasiga soling va elutsiya tamponini qo'shing.

Keyin membrana orqali elyusiya tamponini majburlash uchun santrifüj qilinadi.Elyusiya buferi virusli RNKni spin ustunidan olib tashlaydi va oqsillar, inhibitorlar va boshqa ifloslantiruvchi moddalardan tozalangan RNKni oladi.

2-QADAM

Aralash konsentrat

Virusli RNKni ajratib olgandan so'ng, keyingi qadam PCR kuchaytirilishi uchun reaktsiya aralashmasini tayyorlashdir.Ushbu bosqichda konsentrat ishlatiladi.Bu konsentrlangan eritma premiks, teskari transkriptaza, nukleotidlar, oldinga primer, teskari primer, TaqMan probi va DNK polimerazadan iborat oldindan aralashtirilgan konsentrlangan eritmadir.

Nihoyat, bu reaksiya aralashmasini yakunlash uchun RNK shabloni qo'shiladi.Naychalar impulsli vorteks bilan aralashtiriladi, so'ngra reaktsiya aralashmasi PCR plastinkasiga yuklanadi.PCR plitasi odatda 96 ta quduqni o'z ichiga oladi va bir vaqtning o'zida bir nechta namunalarni tahlil qilishi mumkin.

3-QADAM

PCR kuchaytirilishi

Keyinchalik, plastinkani PCR mashinasiga joylashtiring, bu aslida termal sikldir.

Haqiqiy vaqtda RT-PCR RdrRP geni, E geni va N genidagi maqsadli ketma-ketlikni kuchaytirish orqali 2019 yilgi yangi koronavirusni aniqlash uchun ishlatiladi.Maqsadli genni tanlash primer va prob ketma-ketligiga bog'liq.

RT-PCRning birinchi bosqichi teskari transkripsiyadir.Komplementar DNKning birinchi zanjiri sintezlanadi, u virus RNK genomining komplementar qismi bilan bog'langan PCR teskari primeri tomonidan boshlanadi.Keyin teskari transkriptaza DNK nukleotidlarini primerning 3' uchiga qo'shib, virusli RNKni to'ldiruvchi DNKni sintez qiladi.Ushbu bosqichning harorati va davomiyligi ishlatiladigan primerlarga, maqsadli RNKga va teskari transkriptazaga bog'liq.

Keyinchalik, dastlabki denaturatsiya bosqichi qo'llaniladi, bu RNK-DNK gibridining denaturatsiyasiga olib keladi.Bu qadam DNK polimerazasini faollashtirish uchun zarur.Shu bilan birga, teskari transkriptaza inaktivlanadi.

PCR bir qator termal tsikllardan iborat.Har bir tsikl denatürasyon, tavlanish va uzaytirish bosqichlaridan iborat.

Denatürasyon bosqichi reaktsiya kamerasini 95 daraja Selsiygacha qizdirish va uni ikki zanjirli DNK shablonini denatüratsiya qilish uchun ishlatishni o'z ichiga oladi.

Keyingi bosqichda reaktsiya harorati 58 daraja Selsiyga tushiriladi, bu esa oldinga siljishning bir ipli DNK shablonining qo'shimcha qismiga tavlanishiga imkon beradi.Yuvish harorati bevosita astarning uzunligi va tarkibiga bog'liq.

Kengaytma bosqichida DNK polimeraza DNK shablon zanjiriga qo'shimcha bo'lgan yangi DNK zanjirini sintez qiladi.Reaksiya aralashmasidan 5'to 3' yo'nalishda shablonni to'ldiruvchi erkin yadrolarni qo'shish orqali.Ushbu bosqichning harorati ishlatiladigan DNK polimerazasiga bog'liq.

Birinchi tsikldan so'ng, ikki zanjirli DNK nishoni olinadi.

Keyin, ikkinchi tsiklga kiring.Ikki zanjirli DNK denaturatsiya qilinadi va ikkita bitta zanjirli DNK molekulalari hosil bo'ladi.

Keyingi bosqichda reaksiya harorati pasaytiriladi, primerlar har bir bitta zanjirli DNK shabloniga, Taq-man probi esa maqsadli DNKning komplementar qismiga tavlanadi.

TaqMan zondi oligonukleotid probining 5' uchi bilan kovalent bog'langan florofordan iborat.Tsiklning yorug'lik manbai tomonidan hayajonlanganda, florofor flüoresans chiqaradi.Bunga qo'shimcha ravishda, prob 3' uchida söndürücüden iborat.Muxbir genining so'ndirgichga yaqinligi floresansni aniqlashga to'sqinlik qiladi.

Kengaytma bosqichida DNK polimeraza yangi zanjirni sintez qiladi.Polimeraza TaqMan zondiga yetganda, uning endogen 5'nukleaza faolligi probni ajratib, bo'yoqni söndürücüden ajratadi.

PCR ning har bir tsikli bilan ko'proq bo'yoq molekulalari chiqariladi, bu sintez qilingan amplikonlarning soniga mutanosib ravishda floresan intensivligining oshishiga olib keladi.

Bu usul namunadagi berilgan ketma-ketlik sonini baholashga imkon beradi.Ikki zanjirli DNK fragmentlari soni har bir siklda ikki barobar ortadi.Shuning uchun PCR juda kichik namunalarni tahlil qilish uchun ishlatilishi mumkin.

Floresan signalini o'lchash uchun volfram halogen lampasi, qo'zg'atuvchi filtr, reflektor, linzalar, emissiya filtri va zaryad bilan bog'langan CCD kamera.

4-QADAM Aniqlash

Floresan signalini o'lchash uchun volfram halogen lampasi, qo'zg'atuvchi filtr, reflektor, linzalar, emissiya filtri va zaryad bilan bog'langan CCD kamera.

Chiroqdan filtrlangan yorug'lik reflektor tomonidan aks ettiriladi, kondensator linzalari orqali o'tadi va har bir teshikning markaziga qaratilgan.Keyin teshikdan chiqarilgan floresan ko'zgudan aks etadi, emissiya filtridan o'tadi va CCD kamerasi tomonidan aniqlanadi.Har bir PCR siklida o'z-o'zidan qo'zg'atilgan florofor nuri CCD tomonidan aniqlanishi mumkin.

U olingan yorug'likni raqamli ma'lumotlarga aylantiradi.Ushbu usul real vaqtda PCR deb ataladi va u PCR reaktsiyasining borishini real vaqt rejimida kuzatish imkonini beradi.