Laboratoriyada yangi bo'lib, past konvertatsiya darajasiga ega bo'lgan o'simliklar to'plamidan ijobiy o'simliklarni saralash yaxshi ish emas.Birinchidan, ko'p miqdordagi namunalardan DNKni birma-bir ajratib olish kerak, keyin esa begona genlar PCR orqali aniqlanadi.Biroq, natijalar ko'pincha blankalar va ba'zan bir nechta elementlardan iborat bantlardir, ammo o'tkazib yuborilgan yoki noto'g'ri aniqlashlar mavjudligini aniqlash mumkin emas..Bunday eksperimental jarayon va natijalarga duch kelish juda ojizmi?Xavotir olmang, birodar sizga transgen ijobiy o'simliklarni qanday qilib oson va aniq tekshirishni o'rgatadi.

1-qadam

Dizaynni aniqlash primerlari

Tekshiriladigan namunaga ko'ra aniqlanadigan endogen gen va ekzogen genni aniqlang va primer dizayni uchun genda vakili 100-500bp ketma-ketligini tanlang.Yaxshi primerlar aniqlash natijalarining aniqligini ta'minlashi va aniqlash vaqtini qisqartirishi mumkin (ko'p ishlatiladigan aniqlash primerlari uchun ilovaga qarang).

Eslatma: Yangi ishlab chiqilgan primerlar reaksiya sharoitlarini optimallashtirishi va keng miqyosli aniqlashdan oldin aniqlashning aniqligi, aniqligi va aniqlash chegarasini tekshirishi kerak.

2-qadam

Eksperimental protokolni loyihalash

Ijobiy nazorat: PCR reaktsiya tizimi va shartlari normal yoki yo'qligini aniqlash uchun maqsadli fragmentni o'z ichiga olgan tozalangan DNKdan shablon sifatida foydalaning.

Salbiy/bo'sh nazorat: PCR tizimida ifloslanish manbasi mavjudligini aniqlash uchun shablon sifatida maqsadli fragmentni o'z ichiga olmaydigan DNK shablonini yoki ddH2O dan foydalaning.

Ichki mos yozuvlar nazorati: shablonni PCR yordamida aniqlash mumkinligini baholash uchun sinov qilinadigan namunaning endogen genining primer/zond birikmasidan foydalaning.

Eslatma:

Eksperimental natijalarning to'g'riligini baholash uchun har bir test uchun ijobiy, salbiy/bo'sh nazorat va ichki nazorat nazorati o'rnatilishi kerak.

Tajribaga tayyorgarlik

Ishlatishdan oldin eritmaning bir tekis aralashganligiga e'tibor bering.Agar yog'ingarchilik aniqlansa, uni ishlatishdan oldin ko'rsatmalarga muvofiq eritib, aralashtirish kerak.Ionning notekis taqsimlanishiga yo'l qo'ymaslik uchun ishlatishdan oldin 2 × PCR aralashmasini pipetlash va mikropipet bilan qayta-qayta aralashtirish kerak.

Eslatma:

Qo'llanmani chiqarib oling va uni diqqat bilan o'qing va qo'llanma talablariga qat'iy rioya qilgan holda tajribadan oldin tayyorgarlik ko'ring.

4-qadam

PCR reaktsiya tizimini tayyorlang

Eksperimental protokolga ko'ra, primerlarni, H2O va 2 × PCR aralashmasini teng ravishda aralashtiring, santrifüj qiling va ularni har bir reaksiya naychasiga taqsimlang.

Eslatma:

Keng miqyosli yoki uzoq muddatli sinovlar uchun UNG fermentini o'z ichiga olgan PCR reaktsiyasi tizimidan foydalanish tavsiya etiladi, bu esa PCR mahsulotlaridan kelib chiqqan aerozol bilan ifloslanishini samarali oldini oladi.

5-qadam

Reaksiya shablonini qo'shing

To'g'ridan-to'g'ri PCR texnologiyasidan foydalangan holda, zerikarli nuklein kislotasini tozalash jarayoniga ehtiyoj qolmaydi, namuna shablonini 10 daqiqa ichida tayyorlash mumkin va mos keladigan PCR reaktsiya tizimini qo'shish mumkin.

Eslatma:

Bo'linish usuli yaxshiroq aniqlash effektiga ega va olingan mahsulot bir nechta aniqlash reaktsiyalari uchun ishlatilishi mumkin.

5.1: Barglarning bevosita kengayishi

Qo'llanmadagi rasmning o'lchamiga ko'ra, 2-3 mm diametrli barg to'qimasini kesib oling va uni PCR reaktsiya tizimiga joylashtiring.

Eslatma: Barg parchalari PCR reaktsiyasi eritmasiga to'liq botirilishiga ishonch hosil qiling va ortiqcha barg to'qimasini qo'shmang.

5.2: Barglarni ajratish usuli

Barg to'qimasini 5-7 mm diametrli kesib oling va uni santrifüj naychasiga joylashtiring.Agar siz etuk barglarni tanlasangiz, iltimos, bargning asosiy tomirining to'qimalarini ishlatmang.Pipetka 50ul Buffer P1 lizatini sentrifuga trubasiga soling, lizat barg to‘qimasini to‘liq botirsin, uni termal siklatorga yoki metall vannaga soling va 95°C da 5-10 daqiqa davomida lizing qiling.

50ul Buffer P2 neytrallash eritmasini qo'shing va yaxshilab aralashtiring.Olingan lizat shablon sifatida ishlatilishi va PCR reaktsiyasi tizimiga qo'shilishi mumkin.

Eslatma: Shablon miqdori PCR tizimining 5-10% ni tashkil qiladi va 20% dan oshmasligi kerak (masalan, 20 mkl PCR tizimida 1-2 mkl lizis eritmasi qo'shing, 4 mkl dan oshmasligi kerak).

6-qadam

PCR reaktsiyasi

PCR reaksiya trubkasi santrifüj qilingandan so'ng, u kuchaytirish uchun PCR asbobiga joylashtiriladi.

Eslatma:

Reaksiya kuchaytirilishi uchun tozalanmagan shablondan foydalanadi, shuning uchun kuchaytirish davrlari soni tozalangan DNK shablonidan foydalangandan ko'ra 5-10 tsiklga ko'proq.

7-qadam

Elektroforezni aniqlash va natijalarni tahlil qilish

M: 100bp DNK zinapoyasi

1\4: Tozalangan DNK usuli

2\5: To'g'ridan-to'g'ri PCR usuli

3\6: Bo'sh boshqaruv

QC:

Tajribada o'rnatilgan turli nazoratlarning sinov natijalari quyidagi shartlarga javob berishi kerak.Aks holda, muammoning sababini tahlil qilish kerak va muammo bartaraf etilgandan so'ng test yana o'tkazilishi kerak.

Jadval 1. Turli nazorat guruhlarining normal sinov natijalari

* Plazmid ijobiy nazorat sifatida ishlatilsa, endogen gen testi natijasi salbiy bo'lishi mumkin

Natija hukmi:

A. Namunaning endogen genini tekshirish natijasi manfiy bo‘lib, oddiy PCR aniqlash uchun mos bo‘lgan DNKni namunadan ajratib bo‘lmaydi yoki olingan DNKda PCR reaktsiyasi inhibitörleri bor va DNK yana ekstraksiya qilinishi kerakligini ko‘rsatadi.

B. Namunaning endogen genini tekshirish natijasi ijobiy, ekzogen genning test natijasi esa manfiy bo‘lib, oddiy PCR aniqlash uchun mos DNK namunadan olinganligini ko‘rsatadi va XXX geni namunada aniqlanmagan deb hukm qilish mumkin.

C. Namunaning endogen genining test natijasi ijobiy va ekzogen genning test natijasi ijobiy bo'lib, namunadan oddiy PCR aniqlash uchun mos DNK olinganligini ko'rsatadi va namuna DNKsi XXX genini o'z ichiga oladi.Tasdiqlash tajribalari qo'shimcha ravishda o'tkazilishi mumkin.

8-qadam

Dizaynni aniqlash primerlari

Tajribadan so'ng, atrof-muhit ifloslanishining oldini olish uchun eksperimental maydonni tozalash uchun 2% natriy gipoxlorit eritmasi va 70% etanol eritmasidan foydalaning.