Umumiy koʻrinish
Transgen o'simliklarni tezkor aniqlash
Matn/Tong Yucheng
Eksperimental operatsiya / Xan Ying
Muharrir/Ven Youjun
So'zlar/1600+
Tavsiya etilgan o'qish vaqti / 8-10 daqiqa
Transgen o'simliklarni tezkor aniqlash
Laboratoriyada yangi kelgan sifatida, past konvertatsiya darajasiga ega bo'lgan o'simliklar to'plamidan ijobiy o'simliklarni saralash yaxshi ish emas.Birinchidan, ko'p miqdordagi namunalardan DNKni birma-bir ajratib olish kerak, keyin esa begona genlar PCR orqali aniqlanadi.Biroq, natijalar ko'pincha blankalar va ba'zan bir nechta elementlardan iborat bantlardir, ammo o'tkazib yuborilgan yoki noto'g'ri aniqlashlar mavjudligini aniqlash mumkin emas..Bunday eksperimental jarayon va natijalarga duch kelish juda ojizmi?Xavotir olmang, birodar sizga transgen ijobiy o'simliklarni qanday qilib oson va aniq tekshirishni o'rgatadi.
1-qadam: Dizaynni aniqlash primerlari
Tekshiriladigan namunaga ko'ra aniqlanadigan endogen gen va ekzogen genni aniqlang va primer dizayni uchun genda vakili 100-500bp ketma-ketligini tanlang.Yaxshi primerlar aniqlash natijalarining aniqligini ta'minlashi va aniqlash vaqtini qisqartirishi mumkin (ko'p ishlatiladigan aniqlash primerlari uchun ilovaga qarang).
Eslatma:
Yangi ishlab chiqilgan primerlar reaksiya sharoitlarini optimallashtirishi va keng miqyosli aniqlashni amalga oshirishdan oldin aniqlashning aniqligi, aniqligi va aniqlash chegarasini tekshirishi kerak.
2-qadam:Eksperimental protokolni ishlab chiqish
Ijobiy nazorat: PCR reaktsiya tizimi va shartlari normal yoki yo'qligini aniqlash uchun maqsadli fragmentni o'z ichiga olgan tozalangan DNKdan shablon sifatida foydalaning.
Salbiy/bo'sh nazorat: DNK shablonini yoki ddH dan foydalaning2PCR tizimida ifloslanish manbasi mavjudligini aniqlash uchun shablon sifatida maqsadli fragmentni o'z ichiga olmaydi.
Ichki mos yozuvlar nazorati: shablonni PCR yordamida aniqlash mumkinligini baholash uchun sinov qilinadigan namunaning endogen genining primer/zond birikmasidan foydalaning.
Eslatma:
Eksperimental natijalarning to'g'riligini baholash uchun har bir test uchun ijobiy, salbiy/bo'sh nazorat va ichki nazorat nazorati o'rnatilishi kerak.
3-qadam: Tajribaga tayyorgarlik
Ishlatishdan oldin eritmaning bir tekis aralashganligiga e'tibor bering.Agar yog'ingarchilik aniqlansa, uni ishlatishdan oldin ko'rsatmalarga muvofiq eritib, aralashtirish kerak.Ionning notekis taqsimlanishiga yo'l qo'ymaslik uchun ishlatishdan oldin 2 × PCR aralashmasini pipetlash va mikropipet bilan qayta-qayta aralashtirish kerak.
Eslatma:
Ko'rsatmalarni chiqarib oling va ularni diqqat bilan o'qing va ko'rsatmalarga qat'iy rioya qilgan holda tajriba oldidan tayyorgarlik ko'ring.
4-qadam: PCR reaktsiya tizimini tayyorlang
Eksperimental protokolga ko'ra, primerlarni aralashtiring, H2O, 2×PCR aralashtiriladi, sentrifuga qilinadi va har bir reaksiya trubasiga taqsimlanadi.
Eslatma:
Keng miqyosli yoki uzoq muddatli sinovlar uchun UNG fermentini o'z ichiga olgan PCR reaktsiyasi tizimidan foydalanish tavsiya etiladi, bu esa PCR mahsulotlaridan kelib chiqqan aerozol bilan ifloslanishini samarali oldini oladi.
5-qadam: Reaksiya shablonini qo'shing
Direct PCR texnologiyasidan foydalangan holda, zerikarli nuklein kislotani tozalash jarayoniga ehtiyoj qolmaydi.Namuna shablonini 10 daqiqa ichida tayyorlash va tegishli PCR reaktsiya tizimiga qo'shish mumkin.
Eslatma:
Lizis usuli yaxshiroq aniqlash effektiga ega va olingan mahsulot bir nechta aniqlash reaktsiyalari uchun ishlatilishi mumkin.
5.1: Barglarning bevosita PCR
Qo'llanmadagi rasmning o'lchamiga ko'ra, 2-3 mm diametrli barg to'qimasini kesib oling va uni PCR reaktsiya tizimiga joylashtiring.
Eslatma: Barg parchalari PCR reaktsiyasi eritmasiga to'liq botirilishiga ishonch hosil qiling va ortiqcha barg to'qimasini qo'shmang.
5.2: Barglarni parchalash usuli
Barg to'qimasini 5-7 mm diametrli kesib oling va uni santrifüj naychasiga joylashtiring.Agar siz etuk barglarni tanlasangiz, iltimos, bargning asosiy tomirining to'qimalarini ishlatmang.Pipetka 50ul Buffer P1 lizatini sentrifuga trubasiga soling, lizat barg to‘qimasini to‘liq botirsin, uni termal siklatorga yoki metall vannaga soling va 95°C da 5-10 daqiqa davomida lizing qiling.
50ul Buffer P2 neytrallash eritmasini qo'shing va yaxshilab aralashtiring.Olingan lizat shablon sifatida ishlatilishi va PCR reaktsiyasi tizimiga qo'shilishi mumkin.
Eslatma: Shablon miqdori PCR tizimining 5-10% oralig'ida bo'lishi kerak va 20% dan oshmasligi kerak (masalan, 20 mkl PCR tizimida 1-2 mkl lizis buferini qo'shing, 4 mkl dan oshmasligi kerak).
6-qadam: PCR reaktsiyasi
PCR reaksiya trubkasini santrifüj qilgandan so'ng, ularni kuchaytirish uchun PCR asbobiga joylashtiring.
Eslatma:
Reaksiya kuchaytirilishi uchun tozalanmagan shablondan foydalanadi, shuning uchun kuchaytirish davrlari soni tozalangan DNK shablonidan foydalangandan ko'ra 5-10 tsiklga ko'proq.
7-qadam: Elektroforezni aniqlash va natijalarni tahlil qilish
M: 100bp DNK zinapoyasi
1\4: Tozalangan DNK usuli
2\5: To'g'ridan-to'g'ri PCR usuli
3\6: Bo'sh boshqaruv
Sifat nazorati:
Tajribada o'rnatilgan turli nazorat vositalarining sinov natijalari quyidagi shartlarga javob berishi kerak.Aks holda, muammoning sababini tahlil qilish kerak va muammo bartaraf etilgandan so'ng test yana o'tkazilishi kerak.
Jadval 1. Turli nazorat guruhlarining normal sinov natijalari
* Plazmid ijobiy nazorat sifatida ishlatilsa, endogen gen testi natijasi salbiy bo'lishi mumkin
Natija hukmi:
A. Namunaning endogen genini tekshirish natijasi manfiy bo‘lib, oddiy PCR aniqlash uchun mos bo‘lgan DNKni namunadan ajratib bo‘lmaydi yoki olingan DNKda PCR reaktsiyasi inhibitörleri bor va DNK yana ekstraksiya qilinishi kerakligini ko‘rsatadi.
B. Namunaning endogen genini tekshirish natijasi ijobiy, ekzogen genning test natijasi esa manfiy bo‘lib, oddiy PCR aniqlash uchun mos DNK namunadan olinganligini ko‘rsatadi va XXX geni namunada aniqlanmagan deb xulosa chiqarish mumkin.
C. Namunaning endogen genining test natijasi ijobiy, ekzogen genning test natijasi ijobiy bo'lib, oddiy PCR aniqlash uchun mos DNK namunadan olinganligini ko'rsatadi va namuna DNKsi XXX genini o'z ichiga oladi.Tasdiqlash tajribalari qo'shimcha ravishda o'tkazilishi mumkin.
8-qadam: aniqlash primerlarini loyihalash
Tajribadan so'ng, atrof-muhit ifloslanishini oldini olish uchun tajriba maydonini artib olish uchun 2% natriy gipoxlorit eritmasi va 70% etanol eritmasidan foydalaning.
Ilova
Jadval 2. Genetik jihatdan o'zgartirilgan o'simliklarni umumiy PCR aniqlash uchun keng tarqalgan ishlatiladigan primerlar
Malumot hujjati:
SN/T 1202-2010, Oziq-ovqat mahsulotidagi genetik modifikatsiyalangan o'simlik tarkibiy qismlarini sifatli PCR aniqlash usuli.
Qishloq xo'jaligi vazirligining 1485-5-2010-sonli e'loni, Genetik modifikatsiyalangan o'simliklar va ularning mahsulotlari - guruch M12 va uning hosilalari tarkibiy qismlarini sinovdan o'tkazish.
Yuborilgan vaqt: 09-iyun-2021
