、Reaksiya tizimining sezgirligini oshirish:

1. Yuqori sifatli RNKni ajratib oling:

Muvaffaqiyatli cDNK sintezi yuqori sifatli RNKdan kelib chiqadi.Yuqori sifatli RNK hech bo'lmaganda to'liq uzunlikdagi bo'lishi va EDTA yoki SDS kabi teskari transkriptaza inhibitörlerinden xoli bo'lishi kerak.RNK sifati cDNKga transkripsiya qilishingiz mumkin bo'lgan ketma-ketlik ma'lumotlarining maksimal miqdorini aniqlaydi.Umumiy RNKni tozalash usuli guanidin izotiyosiyanat/kislotali fenoldan foydalangan holda bir bosqichli usuldir.RNase ning iz miqdori bilan ifloslanishini oldini olish uchun RNazga boy namunalardan (masalan, oshqozon osti bezi) ajratilgan RNK yuqori sifatli RNKni, ayniqsa uzoq muddatli saqlash uchun formaldegidda saqlanishi kerak.Sichqon jigaridan olingan RNK bir hafta davomida suvda saqlanganidan so'ng asosan degradatsiyaga uchradi, kalamush taloqidan olingan RNK esa 3 yil davomida suvda saqlanganidan keyin barqaror bo'lib qoldi.Bundan tashqari, 4 kb dan ortiq transkriptlar kichik transkriptlarga qaraganda iz RNase tomonidan degradatsiyaga nisbatan sezgirroqdir.Saqlangan RNK namunalarining barqarorligini oshirish uchun RNKni deionizatsiyalangan formamidda eritib, -70 ° C da saqlash mumkin.RNKni saqlab qolish uchun ishlatiladigan formamid RNKni buzuvchi qoldiqlardan xoli bo'lishi kerak.Oshqozon osti bezi RNKsi formamidda kamida bir yil saqlanishi mumkin.RNK dan foydalanishga tayyorlanayotganda RNK ni cho’ktirish uchun quyidagi usuldan foydalanish mumkin: 0,2M ga NaCl va 4 marta ko’p miqdorda etanol qo’shing, xona haroratida 3-5 minutga qo’ying va 10000×g da 5 minut sentrifuga qiling.

2. RNaseH-inaktiv (RNaseH-) teskari transkriptazadan foydalaning:

RNaz inhibitörleri ko'pincha cDNK sintezining uzunligi va rentabelligini oshirish uchun teskari transkripsiya reaktsiyalariga qo'shiladi.RNase ingibitorlari birinchi zanjirli sintez reaktsiyasi vaqtida bufer va qaytaruvchi vosita (masalan, DTT) ishtirokida qo'shilishi kerak, chunki cDNK sintezidan oldingi jarayon inhibitorni denatüratsiya qiladi va shu bilan RNKni parchalashi mumkin bo'lgan bog'langan RNazni chiqaradi.Protein RNase ingibitorlari faqat RNKning A, B, C RNase tomonidan degradatsiyasini oldini oladi va teriga RNase ning oldini olmaydi, shuning uchun bu inhibitorlardan foydalanishga qaramay, RNazni barmoqlaringizdan kiritmaslikdan ehtiyot bo'ling.

Teskari transkriptaza RNKning cDNK ga aylanishini katalizlaydi.M-MLV ham, AMV ham o'zlarining polimeraza faolligiga qo'shimcha ravishda endogen RNaseH faolligiga ega.RNaseH faolligi va polimeraza faolligi RNK shabloni va DNK primeri yoki cDNK kengaytma zanjiri o'rtasida hosil bo'lgan gibrid zanjir uchun bir-biri bilan raqobatlashadi va RNK: DNK kompleksidagi RNK zanjirini buzadi.RNaseH faolligi bilan buzilgan RNK shabloni endi cDNK sintezi uchun samarali substrat bo'lib xizmat qila olmaydi, bu cDNK sintezining rentabelligini va uzunligini kamaytiradi.Shuning uchun, teskari transkriptazaning RNaseH faolligini yo'q qilish yoki sezilarli darajada kamaytirish foydali bo'ladi.

SuperScript Ⅱ teskari transkriptaza, RNaseH- MMLV teskari transkriptaza va termoScript teskari transkriptaza, RNaseH- AMV MMLV va AMV ga qaraganda ko'proq miqdor va to'liq uzunlikdagi cDNKni olishi mumkin.RT-PCR sezgirligiga cDNK sintezi miqdori ta'sir qiladi.ThermoScript AMVga qaraganda ancha sezgir.RT-PCR mahsulotlarining hajmi teskari transkriptazaning cDNKni sintez qilish qobiliyati bilan cheklangan, ayniqsa kattaroq cDNKlarni klonlashda.MMLV bilan solishtirganda, SuperScripⅡ uzoq RT-PCR mahsulotlarining hosildorligini sezilarli darajada oshirdi.RNaseH-teskari transkriptaza ham termostabillikni oshirdi, shuning uchun reaksiya normal 37-42 ° C dan yuqori haroratlarda amalga oshirilishi mumkin.Tavsiya etilgan sintez sharoitida oligo(dT) primeri va 10 mCi [a-P]dCTP dan foydalaning.Birinchi ipning umumiy hosildorligi TCA yog'ingarchilik usuli yordamida hisoblab chiqilgan.To'liq uzunlikdagi cDNK o'lchami bo'yicha saralangan bantlar yordamida tahlil qilindi va ishqoriy agaroz jelida hisoblandi.

3. Teskari transkripsiya uchun inkubatsiya haroratini oshiring:

Yuqori inkubatsiya harorati RNKning ikkilamchi strukturasini ochishga yordam beradi, bu reaksiya hosildorligini oshiradi.Aksariyat RNK shablonlari uchun RNK va primerlarni 65°C da tampon yoki tuzsiz inkubatsiya qilish, so‘ngra muz ustida tez sovutish ko‘pchilik ikkilamchi tuzilmalarni yo‘q qiladi va primerlarni bog‘lash imkonini beradi.Biroq, ba'zi shablonlarda issiqlik denaturatsiyasidan keyin ham ikkilamchi tuzilmalar mavjud.Ushbu qiyin shablonlarni kuchaytirish ThermoScript teskari transkriptaza yordamida va kuchaytirishni yaxshilash uchun teskari transkripsiya reaktsiyasini yuqori haroratda joylashtirish orqali amalga oshirilishi mumkin.Yuqori inkubatsiya harorati ham o'ziga xoslikni oshirishi mumkin, ayniqsa genga xos primerlar (GSP) cDNK sintezi uchun ishlatilganda (3-bobga qarang).Agar GSP dan foydalansangiz, primerlarning Tm kutilgan inkubatsiya harorati bilan bir xil ekanligiga ishonch hosil qiling.60°C dan yuqori oligo(dT) va tasodifiy primerlardan foydalanmang.Tasodifiy primerlar 60 ° C ga ko'tarilgunga qadar 25 ° C da 10 daqiqa davomida inkubatsiya qilishni talab qiladi.Yuqori teskari transkripsiya haroratidan foydalanish bilan bir qatorda, o'ziga xoslikni RNK/primer aralashmasini 65°C denaturatsiya haroratidan teskari transkripsiya inkubatsiya haroratiga to'g'ridan-to'g'ri o'tkazish va oldindan qizdirilgan 2 × reaktsiya aralashmasini (cDNA issiq boshlash sintezi) qo'shish orqali yaxshilash mumkin.Ushbu yondashuv past haroratlarda yuzaga keladigan molekulalararo asos juftligini oldini olishga yordam beradi.RT-PCR uchun zarur bo'lgan bir nechta haroratni almashtirish termal siklator yordamida soddalashtirilishi mumkin.

Tth termostabil polimeraza Mg2+ ishtirokida DNK polimeraza, Mn2+ ishtirokida esa RNK polimeraza vazifasini bajaradi.Maksimal 65 ° C haroratda issiq saqlanishi mumkin.Biroq, PCR paytida Mn2+ mavjudligi ishonchlilikni pasaytiradi, bu Tth polimerazasini cDNKni klonlash kabi yuqori aniqlikdagi kuchaytirish uchun kamroq mos keladi.Bundan tashqari, Tth past teskari transkripsiya samaradorligiga ega, bu sezgirlikni pasaytiradi va teskari transkripsiya va PCR bitta ferment bilan amalga oshirilishi mumkinligi sababli, teskari transkripsiyasiz nazorat reaktsiyalarini cDNK kuchaytiruvchi mahsulotlarni ifloslantiruvchi genomik DNK bilan solishtirish uchun ishlatib bo'lmaydi.Kuchaytirish mahsulotlari ajratildi.

4. Teskari transkripsiyani kuchaytiruvchi qo'shimchalar:

Glitserin va DMSO ni o'z ichiga olgan qo'shimchalar birinchi zanjirli sintez reaktsiyasiga qo'shiladi, bu nuklein kislotaning ikki qatorli barqarorligini pasaytiradi va RNKning ikkilamchi tuzilishini echib oladi.SuperScript II yoki MMLV faolligiga ta'sir qilmasdan 20% gacha glitserin yoki 10% DMSO qo'shilishi mumkin.AMV shuningdek, faollikni yo'qotmasdan 20% gacha glitseringa bardosh bera oladi.SuperScriptⅡ teskari transkripsiya reaktsiyasida RT-PCR sezgirligini maksimal darajada oshirish uchun 10% glitserin qo'shilishi va 45°C da inkubatsiya qilinishi mumkin.Agar teskari transkripsiya reaktsiyasi mahsulotining 1/10 qismi PCRga qo'shilsa, unda kuchaytirish reaktsiyasida glitserin konsentratsiyasi 0,4% ni tashkil qiladi, bu PCRni inhibe qilish uchun etarli emas.

5. RNaseH bilan davolash:

PCRdan oldin cDNK sintezi reaktsiyalarini RNaseH bilan davolash sezgirlikni oshirishi mumkin.Ba'zi shablonlar uchun cDNK sintez reaktsiyasidagi RNK kuchaytiruvchi mahsulotlarning bog'lanishiga to'sqinlik qiladi, deb hisoblashadi, bu holda RNaseH bilan davolash sezgirlikni oshirishi mumkin.Odatda, RNaseH bilan davolash uzoqroq to'liq uzunlikdagi cDNK maqsadli shablonlarini, masalan, past nusxali tuberous skerozi II kuchaytirganda zarur.Ushbu qiyin shablon uchun RNaseH bilan davolash SuperScript II yoki AMV-sintezlangan cDNK tomonidan ishlab chiqarilgan signalni kuchaytirdi.Ko'pgina RT-PCR reaktsiyalari uchun RNaseH bilan davolash ixtiyoriydir, chunki 95 ° C da PCR denatürasyon bosqichi odatda RNK: DNK kompleksidagi RNKni gidrolizlaydi.

6. Kichik RNKni aniqlash usulini takomillashtirish:

RNKning kichik miqdori mavjud bo'lganda RT-PCR ayniqsa qiyin.RNK izolyatsiyasi paytida tashuvchi sifatida qo'shilgan glikogen kichik namunalar hosildorligini oshirishga yordam beradi.Trizolni qo'shish bilan bir vaqtda RNazsiz glikogen qo'shilishi mumkin.Glikogen suvda eriydi va keyingi yog'ingarchiliklarga yordam berish uchun RNK bilan suvli fazada saqlanishi mumkin.50 mg dan kam to'qima yoki 106 kulturali hujayra namunalari uchun RNazsiz glikogenning tavsiya etilgan konsentratsiyasi 250 mkg/ml ni tashkil qiladi.

SuperScript II yordamida teskari transkripsiya reaktsiyasiga atsetillangan BSA qo'shilishi sezgirlikni oshirishi mumkin, kichik miqdordagi RNK uchun esa SuperScript II miqdorini kamaytirish va 40 birlik RNaseOut nukleaza inhibitori qo'shilishi aniqlash darajasini oshirishi mumkin.Agar RNKni izolyatsiyalash jarayonida glikogen ishlatilsa, teskari transkripsiya reaktsiyasi uchun SuperScript II dan foydalanganda BSA yoki RNase inhibitorini qo'shish tavsiya etiladi.

、RT-PCR o'ziga xosligini oshirish

1. CND asintezi:

Birinchi zanjirli cDNK sintezi uch xil usul yordamida boshlanishi mumkin, ularning nisbiy o'ziga xosligi sintez qilingan cDNK miqdori va turiga ta'sir qiladi.

Tasodifiy primer usuli uchta usulning eng kam o'ziga xosligi edi.Primerlar transkript davomida bir nechta joylarda tavlanib, qisqa, qisman uzunlikdagi cDNKlarni hosil qiladi.Bu usul tez-tez 5 ′ so'nggi ketma-ketliklarni olish va ikkilamchi tuzilish mintaqalari yoki teskari transkriptaza bilan takrorlanmaydigan tugatish joylari bo'lgan RNK shablonlaridan cDNK olish uchun ishlatiladi.Eng uzun cDNKni olish uchun har bir RNK namunasidagi primerlarning RNKga nisbati empirik tarzda aniqlanishi kerak.Tasodifiy primerlarning boshlang'ich kontsentratsiyasi 20 mkl reaktsiya uchun 50 dan 250 ng gacha bo'lgan.Tasodifiy primerlar yordamida jami RNKdan sintez qilingan cDNK asosan ribosoma RNK bo'lganligi sababli, shablon sifatida odatda poli(A)+RNK tanlanadi.

Oligo (dT) primerlari tasodifiy primerlarga qaraganda o'ziga xosdir.Ko'pgina eukaryotik mRNKlarning 3' uchida joylashgan poli(A) dumiga gibridlanadi.Poli(A)+ RNK umumiy RNKning taxminan 1% dan 2% gacha bo'lganligi sababli, cDNK miqdori va murakkabligi tasodifiy primerlarga qaraganda ancha past.Oligo (dT) o'zining yuqori o'ziga xosligi tufayli, odatda, RNKning primerlarga nisbatini optimallashtirishni va poli(A)+ tanlashni talab qilmaydi.20 mkl reaktsiya tizimi uchun 0,5 mkg oligo (dT) dan foydalanish tavsiya etiladi.oligo(dT)12-18 ko'pchilik RT-PCR uchun javob beradi.ThermoScript RT-PCR tizimi yuqori inkubatsiya harorati uchun yaxshi termal barqarorligi tufayli oligo(dT)20 ni taklif qiladi.

Genga xos primerlar (GSP) teskari transkripsiya bosqichi uchun eng o'ziga xos primerlardir.GSP antisens oligonükleotid bo'lib, u tasodifiy primerlar yoki barcha RNKlarga bog'laydigan oligo (dT) dan farqli ravishda RNK maqsadli ketma-ketligiga gibridlanishi mumkin.PCR primerlarini loyihalashda qo'llaniladigan xuddi shu qoidalar teskari transkripsiya reaktsiyalarida GSP dizayni uchun qo'llaniladi.GSP mRNK ning 3'-eng uchiga tavlanadigan kuchaytiruvchi primer bilan bir xil ketma-ketlikda bo'lishi mumkin yoki GSP teskari kuchaytiruvchi primerning quyi oqimida tavlanish uchun mo'ljallangan bo'lishi mumkin.Ba'zi kuchaytirilgan sub'ektlar uchun muvaffaqiyatli RT-PCR uchun bir nechta antisensli primer ishlab chiqilishi kerak, chunki maqsadli RNKning ikkilamchi tuzilishi primer bog'lanishiga to'sqinlik qilishi mumkin.20 mkl birinchi zanjirli sintez reaktsiyasida 1 pmol antisens GSP dan foydalanish tavsiya etiladi.

2. Teskari transkripsiya uchun inkubatsiya haroratini oshiring:

GSP o'ziga xosligining to'liq afzalliklaridan to'liq foydalanish uchun yuqori termostabillikka ega bo'lgan teskari transkriptazadan foydalanish kerak.Termostabil teskari transkriptazalar reaksiyaning qattiqligini oshirish uchun yuqori haroratlarda inkubatsiya qilinishi mumkin.Misol uchun, agar GSP 55 ° C da tavlansa, AMV yoki M-MLV teskari transkripsiya uchun 37 ° C past qattiqlikda ishlatilsa, GSPning o'ziga xosligi to'liq foydalanilmaydi.Biroq, SuperScript II va ThermoScript 50°C yoki undan yuqori haroratda reaksiyaga kirishishi mumkin, bu esa pastroq haroratlarda hosil bo'ladigan o'ziga xos bo'lmagan mahsulotlarni yo'q qiladi.Maksimal o'ziga xoslik uchun RNK/primer aralashmasi to'g'ridan-to'g'ri 65 ° C denaturatsiya haroratidan teskari transkripsiya inkubatsiya haroratiga o'tkazilishi va oldindan qizdirilgan 2 × reaktsiya aralashmasiga qo'shilishi mumkin (cDNK sintezining issiq boshlanishi).Bu past haroratlarda molekulalararo asoslar juftligini oldini olishga yordam beradi.RT-PCR uchun zarur bo'lgan bir nechta harorat o'tishlarini termal siklator yordamida soddalashtirish mumkin.

3. Genomik DNK ifloslanishini kamaytiradi:

RT-PCR bilan duch kelishi mumkin bo'lgan qiyinchilik RNKdagi genomik DNKning ifloslanishidir.Trizol reagenti kabi yaxshi RNK izolyatsiyalash usulidan foydalanish RNK ​​preparatini ifloslantiruvchi genomik DNK miqdorini kamaytiradi.Genomik DNKdan olingan mahsulotlardan qochish uchun RNKni teskari transkripsiyadan oldin ifloslantiruvchi DNKni olib tashlash uchun kuchaytiruvchi DNaz I bilan davolash mumkin.DNaz I hazm qilish namunalarni 2,0 mM EDTAda 10 daqiqa davomida 65°C da inkubatsiya qilish orqali tugatildi.EDTA magniy ionlarini xelatlashi mumkin, yuqori haroratlarda magniy ioniga bog'liq RNK gidrolizini oldini oladi.

Amplifikatsiya qilingan cDNKni ifloslantiruvchi genomik DNK kuchaytiruvchi mahsulotlardan ajratish uchun primerlar har bir eksonlarni ajratib turadigan qilib ishlab chiqilishi mumkin.cDNK dan olingan PCR mahsulotlari ifloslangan genomik DNK dan olingan mahsulotlarga qaraganda qisqaroq bo'ladi.Bundan tashqari, berilgan fragment genomik DNK yoki cDNK dan olinganligini aniqlash uchun har bir RNK shablonida teskari transkripsiyasiz nazorat tajribasi o'tkazildi.Teskari transkripsiyasiz olingan PCR mahsuloti genomdan olingan.