1. Asosiy bilimlar (agar siz eksperimental qismni ko'rmoqchi bo'lsangiz, to'g'ridan-to'g'ri ikkinchi qismga o'tkazing)
An'anaviy PCRning lotin reaktsiyasi sifatida, Real Time PCR asosan floresan signalining o'zgarishi orqali real vaqt rejimida PCR kuchaytirish reaktsiyasining har bir tsiklida kuchaytirish mahsuloti miqdorining o'zgarishini kuzatib boradi va ct qiymati va standart egri o'rtasidagi munosabatlar orqali boshlang'ich shablonni miqdoriy tahlil qiladi.
RT-PCR ning o'ziga xos ma'lumotlariasosiy chiziq, floresans chegarasivaCt qiymati.
| asosiy: | 3-15-tsiklning floresan qiymati asosiy (asosiy chiziq) bo'lib, u vaqti-vaqti bilan o'lchash xatosidan kelib chiqadi. |
| Chegara (eshik): | Kuchaytirish egri chizig'ining eksponentsial o'sish hududida tegishli pozitsiyada o'rnatilgan floresansni aniqlash chegarasiga ishora qiladi, odatda asosiy chiziqning standart og'ishidan 10 baravar yuqori. |
| CT qiymati: | Bu har bir reaksiya trubkasidagi floresans qiymati chegaraga yetganda, PCR davrlarining soni. Ct qiymati dastlabki shablon miqdoriga teskari proportsionaldir. |
RT-PCR uchun keng tarqalgan etiketlash usullari:
| usuli | afzallik | kamchilik | qo'llash doirasi |
| SYBR GreenⅠ | Keng qo'llanilishi, sezgir, arzon va qulay | Primer talablari yuqori, o'ziga xos bo'lmagan bantlarga moyil | U turli maqsadli genlarni miqdoriy tahlil qilish, genlarni ifodalash bo'yicha tadqiqotlar va transgen rekombinant hayvonlar va o'simliklarni tadqiq qilish uchun javob beradi. |
| TaqMan | Yaxshi o'ziga xoslik va yuqori takroriylik | Narx yuqori va faqat aniq maqsadlar uchun javob beradi. | Patogenni aniqlash, dori-darmonga chidamlilik genini o'rganish, dori samaradorligini baholash, genetik kasalliklar diagnostikasi. |
| molekulyar mayoq | Yuqori o'ziga xoslik, floresans, past fon | Narxi yuqori, u faqat ma'lum bir maqsad uchun mos, dizayni qiyin va narxi yuqori. | Maxsus gen tahlili, SNP tahlili |
2. Eksperimental bosqichlar
2.1 Eksperimental guruhlash haqida- guruhda bir nechta quduq bo'lishi kerak va biologik takrorlanishlar bo'lishi kerak.
| ① | Bo'sh nazorat | Tajribalarda hujayra o'sishi holatini aniqlash uchun ishlatiladi |
| ② | Salbiy nazorat siRNK (o'ziga xos bo'lmagan siRNK ketma-ketligi) | RNK ta'sirining o'ziga xosligini ko'rsating.siRNK 200nM konsentratsiyasida o'ziga xos bo'lmagan stress reaktsiyasini keltirib chiqarishi mumkin. |
| ③ | Transfektsiya reagentini nazorat qilish | Transfektsiya reagentining hujayralarga toksikligini yoki maqsadli genning ekspressiyasiga ta'sirini istisno qiling |
| ④ | maqsadli genga qarshi siRNK | Maqsadli genning ifodasini yo'q qiling |
| ⑤ (ixtiyoriy) | ijobiy siRNK | Eksperimental tizim va operatsion muammolarni bartaraf etish uchun foydalaniladi |
| ⑥ (ixtiyoriy) | Floresan nazorati siRNK | Hujayra transfeksiyasining samaradorligini mikroskop yordamida kuzatish mumkin |
2.2 Astarni loyihalash tamoyillari
| Kuchaytirilgan fragment o'lchami | Tercihen 100-150bp da |
| Astar uzunligi | 18-25bp |
| GC tarkibi | 30%-70%, yaxshisi 45%-55% |
| Tm qiymati | 58-60 ℃ |
| Ketma-ketlik | T/C uzluksizligidan saqlaning;A/G uzluksiz |
| 3 yakuniy ketma-ketlik | GC boy yoki AT boydan saqlaning;terminal bazasi tarjixon G yoki C;T.dan qochish yaxshidir |
| To'ldiruvchilik | Primer ichida yoki ikkita astar o'rtasida 3 dan ortiq asosning qo'shimcha ketma-ketliklaridan saqlaning |
| O'ziga xoslik | Primer o'ziga xosligini tasdiqlash uchun portlash qidiruvidan foydalaning |
①SiRNK turlarga xos bo'lib, turli turlarning ketma-ketligi har xil bo'ladi.
②SiRNK muzlatilgan quritilgan kukunga qadoqlanadi, uni xona haroratida 2-4 hafta davomida barqaror saqlash mumkin.
2.3 Oldindan tayyorlanishi kerak bo'lgan asboblar yoki reagentlar
| Primer (ichki ma'lumotnoma) | Jumladan, oldinga va orqaga ikkita |
| Primerlar (maqsadli gen) | Jumladan, oldinga va orqaga ikkita |
| Target Si RNK (3 ta chiziq) | Umuman olganda, kompaniya 3 ta chiziqni sintez qiladi va keyin RT-PCR orqali uchtadan birini tanlaydi. |
| Transfektsiya to'plami | Lipo2000 va boshqalar. |
| RNKning tezkor ekstraktsiyasi to'plami | Transfeksiyadan keyin RNK ekstraktsiyasi uchun |
| Tezkor teskari transkripsiya to'plami | cDNK sintezi uchun |
| PCR kuchaytirish to'plami | 2×Super SYBR yashil qPCR Master Mix |
2.4 Muayyan eksperimental bosqichlarda e'tibor berish kerak bo'lgan masalalar bo'yicha:
①siRNK transfeksiya jarayoni
1. Qoplama uchun siz 24 quduqli plastinka, 12 quduqli plastinka yoki 6 quduqli plastinkani tanlashingiz mumkin (24 quduqli plastinkaning har bir qudug'ida tavsiya etilgan o'rtacha RNK kontsentratsiyasi taxminan 100-300 ng / uL ni tashkil qiladi) va hujayralarning optimal transfeksiya zichligi 60% -80% gacha yoki shunga o'xshash.
2. Transfeksiya bosqichlari va maxsus talablar ko'rsatmalarga qat'iy muvofiqdir.
3. Transfeksiyadan so'ng namunalar mRNKni aniqlash (RT-PCR) yoki 48-96 soat ichida (WB) oqsillarni aniqlash uchun 24-72 soat ichida to'planishi mumkin.
② RNK ekstraktsiya jarayoni
1. Ekzogen fermentlar bilan ifloslanishning oldini olish.Bu asosan niqob va qo'lqop kiyishni o'z ichiga oladi;sterillangan pipetka uchlari va EP naychalari yordamida;tajribada ishlatiladigan suv RNazsiz bo'lishi kerak.
2. Tez chiqarish to'plamida tavsiya etilganidan ikki marta bajarish tavsiya etiladi, bu haqiqatan ham tozalik va hosilni yaxshilaydi.
3. Chiqindilarni suyuqlik RNK ustuniga tegmasligi kerak.
③ RNK miqdorini aniqlash
RNK chiqarilgandan so'ng, uni to'g'ridan-to'g'ri Nanodrop yordamida aniqlash mumkin va minimal ko'rsatkich 10ng/ul gacha bo'lishi mumkin.
④Teskari transkripsiya jarayoni
1. RT-qPCR ning yuqori sezuvchanligi tufayli, keyingi Ct ning statistik tahlil uchun juda katta bo'lishi yoki SD juda katta bo'lishining oldini olish uchun har bir namuna uchun kamida 3 ta parallel quduq qilish kerak.
2. Master mixni qayta-qayta muzlatmang va eritmang.
3. Har bir trubka/teshik yangi uchi bilan almashtirilishi kerak!Namuna qo'shish uchun doimiy ravishda bir xil pipetka uchidan foydalanmang!
4. Namunani qo'shgandan keyin 96-quduqli plastinkaga biriktirilgan plyonkani plastinka bilan tekislash kerak.Quvur devoridagi suyuqlik pastga oqishi va havo pufakchalarini olib tashlashi uchun uni mashinaga qo'yishdan oldin santrifüj qilish yaxshidir.
⑤Umumiy egri chiziq tahlili
| Logarifmik o'sish davri yo'q | Shablonning yuqori konsentratsiyasi bo'lishi mumkin |
| KT qiymati yo'q | Floresan signallarini aniqlash uchun noto'g'ri qadamlar; primerlar yoki problarning degradatsiyasi - uning yaxlitligi PAGE elektroforezi bilan aniqlanishi mumkin; shablonning etarli emasligi; shablonlarning degradatsiyasi - namunalarni tayyorlashda aralashmalar va takroriy muzlatish va eritishning kiritilishiga yo'l qo'ymaslik; |
| Ct>38 | Kuchaytirishning past samaradorligi;PCR mahsuloti juda uzun;turli reaksiya komponentlari parchalanadi |
| Chiziqli kuchaytirish egri chizig'i | Problar qayta-qayta muzlash-eritish davrlari yoki yorug'likka uzoq vaqt ta'sir qilish natijasida qisman buzilishi mumkin. |
| Ikki nusxadagi teshiklardagi farq ayniqsa katta | Reaksiya eritmasi to'liq erimaydi yoki reaksiya eritmasi aralashmaydi;PCR asbobining termal hammomi floresan moddalar bilan ifloslangan |
2.5 Ma'lumotlarni tahlil qilish haqida
qPCR ma'lumotlarini tahlil qilish nisbiy miqdoriy va mutlaq miqdorlarga bo'linishi mumkin.Masalan, davolash guruhidagi hujayralar nazorat guruhidagi hujayralar bilan solishtirganda,
X genining mRNKsi necha marta o'zgaradi, bu nisbiy miqdor;ma'lum miqdordagi hujayralarda, X genining mRNKsi
Qancha nusxa bor, bu mutlaq miqdor.Odatda biz laboratoriyada eng ko'p ishlatadigan narsa nisbiy miqdoriy usuldir.Odatda,2-Dct usulieksperimentlarda eng ko'p qo'llaniladi, shuning uchun bu erda faqat ushbu usul batafsil tanishtiriladi.
2-DĔct usuli: Olingan natija eksperimental guruhdagi maqsadli genning nazorat guruhidagi maqsadli genga nisbatan ifodalanishidagi farqdir.Maqsadli genning ham, ichki mos yozuvlar genining ham kuchaytirish samaradorligi 100% ga yaqin bo'lishi va nisbiy og'ish 5% dan oshmasligi kerak.
Hisoblash usuli quyidagicha:
Dct nazorat guruhi = nazorat guruhidagi maqsadli genning ct qiymati – nazorat guruhidagi ichki mos yozuvlar genining ct qiymati
Dct eksperimental guruh = eksperimental guruhdagi maqsadli genning ct qiymati – eksperimental guruhdagi ichki mos yozuvlar genining ct qiymati
Dct=Dct eksperimental guruh-Dct nazorat guruhi
Nihoyat, ifoda darajasidagi farqning karrasini hisoblang:
Fold = 2-DDct ni o'zgartiring (excel funktsiyasiga mos keladigan POWER)
Tegishli mahsulotlar:
Xabar berish vaqti: 2023 yil 20-may
