Yaqinda men ajoyib narsani topdim!Uning atrofidagi ko'plab ilg'or tajriba mutaxassislari hatto ba'zi juda oddiy eksperimental bilimlarni bilishmaydi.

Masalan, quyidagi savollarga javob bera olasizmi?

OD260 va A260 o'rtasida farq bormi?Har biri nimani anglatadi?
OD - optik zichlik (optik zichlik) ning qisqartmasi, A - absorbans (absorbsiya) qisqartmasi, ikkita tushuncha aslida bir xil, "optik zichlik" - "absorbsiya", lekin "optik zichlik" ko'pchilik milliy standartlarga mos keladi va ko'proq standartlashtirilgan.

Odatda biz nuklein kislota kontsentratsiyasini hisoblash uchun OD qiymatini 260nm da o'lchaymiz, shuning uchun 1OD nimani anglatadi?
Nuklein kislota 260 nm to'lqin uzunligida maksimal yutilish cho'qqisiga ega bo'lib, u ham DNK, ham RNKni, shuningdek parchalangan nuklein kislota qismlarini o'z ichiga oladi (bu asosiy nuqta).
260 nm to'lqin uzunligida o'lchangan OD qiymati OD260 sifatida qayd etildi.Agar namuna toza bo'lsa, OD260 qiymati nuklein kislotasi namunasining konsentratsiyasini hisoblashi mumkin.
1 OD260=50 mkg/ml dsDNK (ikki zanjirli DNK)
=37 mkg/ml ssDNK (bir zanjirli DNK)
=40 mkg/ml RNK
=30 mkg/ml dNTP (oligonukleotidlar)
RT-PCR, Realtime-PCR va QPCR o'rtasida bog'liqlik va farq bormi?
RT-PCR teskari transkripsiyali PCRning qisqartmasi
Real Time PCR=qPCR, Quantitative Real Time PCR qisqartmasi
Garchi Real Time PCR (real time floresan kantitativ PCR) va teskari transkripsiyali PCR (teskari transkripsiya PCR) ikkalasi ham RT-PCR sifatida qisqartirilgan ko'rinadi.Ammo xalqaro konventsiya: RT-PCR, xususan, teskari transkripsiyali PCRga ishora qiladi.

Biologiyada DNK/RNK uzunligini tavsiflash uchun ko'p qo'llaniladigan nt, bp va kb qanday?
nt = nukleotid
bp = tayanch juftlik tayanch juftligi
kb = kilobaza

Albatta, ko'pchilik bu mayda-chuydalarga ahamiyat bermaydi deysiz!Hamma buni qiladi va hech kim sizdan bu nima ekanligini so'ramaydi.Bilasizmi, bu keraksiz, to'g'rimi?

Yo'q, Yo'q, Yo'q, buni bilish juda kerak!nima uchun?
Chunki siz maqola joylashtirmoqchisiz!Birodar!Bitirmoqchimisiz yoki ilmiy tadqiqot yutuqlariga intilasizmi, gapirish uchun maqolalarga tayanishingiz kerak!

Nuklein kislotani ajratib olish eng oddiy va asosiy tajriba bo'lishi kerak.Nuklein kislota ekstraktsiyasining sifati keyingi tajribalarning natijalarini bevosita belgilaydi.

Ko‘p marta aytgan bo‘lsam ham, baribir parvo qilmaydigan do‘stlar ko‘p.Bu safar men maqoladan chiqib ketishga qaror qildim!

MIQE deb ataladigan real vaqtda PCR tajribalarini nashr qilish uchun minimal ma'lumot, flüoresan miqdoriy PCR tajribalarini baholash va maqolalarni nashr etish uchun zarur bo'lgan eksperimental ma'lumotlar uchun minimal standartlarni taklif qiluvchi, xalqaro miqyosda boshlangan floresan miqdoriy tajriba yo'riqnomalari to'plamidir.Tajribachi tomonidan taqdim etilgan eksperimental shartlar va tahlil usullari orqali sharhlovchilar tadqiqotchining eksperimental sxemasining haqiqiyligini yaxshiroq baholashlari mumkin.

Ko'rinib turibdiki, nuklein kislotani olish bo'limida quyidagi aniqlash elementlari taklif qilingan:

"E" taqdim etilishi kerak bo'lgan ma'lumotlarni ko'rsatadi va "D" kerak bo'lganda taqdim etilishi kerak bo'lgan ma'lumotlarni bildiradi.

Shakl juda murakkab, aslida men hammadan boshlash kerakligini aytmoqchiman

Nuklein kislotalarni ushbu to'rt jihatdan baholash uchun tozalik (D), hosil (D), yaxlitlik (E) va mustahkamlik (E).

Eksperimental odatlarga ko'ra, birinchi navbatda poklik va kontsentratsiyani baholash usullari haqida gapiring.

OD o'lchovi eksperimentchilar uchun eng sevimli va eng oson aniqlash usuli hisoblanadi.Prinsipga kelsak, men bu erda tafsilotlarga kirmayman.Hozirgi kunda ko'pgina laboratoriyalar nuklein kislota namunalarini to'g'ridan-to'g'ri miqdoriy tahlil qilish uchun ultra-mikro spektrofotometrlardan foydalanadilar.Absorbsiya qiymatini ko'rsatishda dastur to'g'ridan-to'g'ri konsentratsiya qiymatini (nuklein kislotasi, oqsil va floresan bo'yoq) va tegishli nisbatlarni beradi.OD qiymatini tahlil qilishga kelsak, ushbu rasmni saqlang va siz yaxshi bo'lasiz.

Universal OD qiymati yechimlari ro'yxati

Biroq, siz uchun alohida e'lon qilinishi kerak bo'lgan bir nechta ogohlantirishlar mavjud.

(Oxir-oqibat, siz pulni tejashingiz va kerak bo'lguningizcha kutishingiz kerakligini bilaman!)

Eslatma 1 Uskuna

OD qiymatiga turli jihozlar ta'sir qiladi.OD260 ma'lum bir diapazonda ekan, OD230 va OD280 qiymatlari mazmunli bo'ladi.Misol uchun, umumiy Eppendorf D30 ning 260 nm da yutilish diapazoni 0 ~ 3A, Thermo NanoDrop One esa 260 nm da.Absorbsiya diapazoni 0,5 ~ 62,5 A.

Eslatma 2Suyultirish reaktivi

OD qiymatiga turli reagentlarning suyultirilishi ta'sir qilishi mumkin.Masalan, pHda tozalangan RNKning OD260/280 ko'rsatkichi7,5 10 mm Trisbufer esa 1,9-2,1 oralig'ida bo'ladineytral suvli eritmanisbati past bo'ladi, ehtimol atigi 1,8-2,0, lekin bu RNK sifatini o'zgartiradi degani emas Farq.

Eslatma 3Qoldiq moddalar

Qoldiq moddalarning mavjudligi nuklein kislota kontsentratsiyasini o'lchashning aniqligiga ta'sir qiladi, shuning uchun nuklein kislotasi namunalarida oqsil, fenol, polisakkarid va polifenol qoldiqlaridan iloji boricha qochish kerak.

Biroq, aslida, organik reagentlar bilan ekstraktsiya eski usul hisoblanadi.Savdo to'plamlarida ekstraksiya effektiga silika asosidagi adsorbsion ustun yordamida sentrifugalash, olib tashlash qiyin bo'lgan zaharli va zararli organik reagentlardan qochish va hokazolar orqali erishish mumkin. Muammo, masalan,Foregene nuklein kislotasi ekstraktsiyasi to'plami, operatsiya davomida DNase/RNase va zaharli organik reagentlardan foydalanmaydi, tez va xavfsiz, vata'siri hisoblanadiyaxshi(Tasodifan kal, deb aytdi, lekin bilmoqchiman, bilaman).

1-misol: Genomik DNK ekstraktsiyasi hosildorligi va tozaligi

Foregene Tuproq DNK izolyatsiyasi to'plami (DE-05511) turli manbalardan olingan tuproq namunalarini davolaydi va olingan genomik DNK miqdori va tozaligi quyidagi jadvalda ko'rsatilgan:
2-misol: To'qimalarning RNK ekstraktsiyasi unumi va tozaligi

Hayvonlarning umumiy RNK izolyatsiyasi to'plami (RE-03012) turli to'qimalar namunalarini qayta ishladi va olingan RNK miqdori va tozaligi quyidagi jadvalda ko'rsatilgan (sichqoncha to'qimalari uchun):
Biroq, OD qiymati bilan tugagan deb o'ylamang.Oldinda siz uchun chizgan asosiy fikrlarim haqida qayg'urasizmi?

Eslatma

Parchalangan nuklein kislota molekulalari ham absorbansda hisoblab chiqiladi.RNKda genomik DNK qoldiqlari bor deb faraz qilsangiz, OD qiymati juda yuqori bo'lib ko'rinadi, ammo RNKning haqiqiy kontsentratsiyasini aniqlab bo'lmaydi.Sizning RNKingiz bormi yoki yo'qmi, degradatsiya bor-yo'qligi aniq emas, shuning uchun biz hali ham aniqroq xulosa chiqarish uchun keng qamrovli baholash usuliga muhtojmiz, ya'ni MIQE da eslatib o'tilgan nuklein kislotasining yaxlitligini baholash.