Yelimni qayta tiklashni yaxshilash bo'yicha maslahatlar

1. Elektroforez vaqtida namuna yukini oshiring.

2. Yangi tayyorlangan elektroforez tamponidan foydalaning.

3. Yelimni kesishda, elim kesish hajmini kamaytirish uchun faqat elimni chiziqlar bilan kesishga harakat qiling: bir nechta maqsadli bo'laklarga ega elim kerak emas, aks holda bu tiklanish tezligiga ta'sir qiladi.

4. Ikki yoki undan ortiq bo'lak elim eritib bo'lgach, hajmi qanchalik katta bo'lishidan qat'i nazar, kolbadan foydalaning va uni bir xil ustunga o'tkazing.

5. Solda qo'shilgan eritma bir oz ko'proq bo'lishi mumkin, bu DNKning membrana bilan bog'lanishiga ko'proq yordam beradi, lekin odatda 750ul dan oshmaydi.

6. Jelni qayta tiklashning kaliti kolonnadagi eritmaning tuz konsentratsiyasi, kislotaligi (zaryad) va gidrofobikligi orqali DNKni kolonka bilan bog'lashdir.Shuning uchun, agar elektroforez buferining pH qiymati juda yuqori bo'lsa, eritmaga 10ul (pH 5,0, 3mol/L NaAC) qo'shilishi mumkin;membranada DNK molekulalarini yaxshiroq ushlab turish uchun elim eritilgandan so'ng suyuqlikka isitish uchun 30% izopropanol qo'shilishi mumkin.

7. Eluentni qo'shishdan oldin, etanolni to'liq bug'lantirish uchun ustunni xona haroratida bir necha daqiqa (taxminan 10 daqiqa) qoldiring.

8. Nihoyat, qayta tiklash hajmini kamaytirish uchun kamroq eluent qo'shing.Odatda, 30-50 mkl elyuent elyusiya uchun ishlatiladi (juda kam emas, aks holda u membranani ho'llashga qodir emas, bu elyusiyaga mos kelmaydi);membrana bilan bog'langan DNKni to'liq elutsiya qilish uchun elyusiya tomchilari membrananing markazida joylashgan.

9. Eluentni qo'shgandan so'ng, uni 55 graduslik suv hammomida 5 daqiqa davomida elutsiya qilish yoki 50 graduslik suv hammomida 10 daqiqadan ko'proq vaqt davomida joylashtirish yoki parafilm bilan 4 graduslik kechada yopishtirish mumkin, keyin esa ertasi kuni tiklanish uchun santrifüj qilinadi, ta'sir yaxshi.

10. Santrifüjlangan elyuatni yana adsorbsion ustunga qo'shing va yana sentrifuga qiling.

PCR mahsulotlarini qayta tiklash uchun batafsil usullar va protseduralar

1. Oddiy kauchukni qayta ishlash

Agar siz elimni qayta tiklamoqchi bo'lsangiz, qulay va biroz yuqoriroq tiklanish tezligiga ega bo'lgan to'plamdan foydalanish yaxshidir.Agar siz haqiqatan ham uni qo'lda tiklashingiz kerak bo'lsa, elimni kesib bo'lgach, TE hajmini 3 barobar oshirishingiz mumkin.Suv hammomida eritilgandan so'ng fenol, fenol/xloroform tozalanadi va etanol cho'ktiriladi.Bo'ldi shu.

2. Past erish nuqtasi bo'lgan jellardan DNKni tiklash

DNK fragmentlarini tozalash Jel hajmiga teng bo'lgan TE (10 mmol/l Tris-HCl pH8,0, 0,1 mmol/l EDTA) qo'shing va jelni to'liq eritish uchun 5 daqiqa davomida 65 ° C li suv hammomiga qo'ying.

Xona haroratiga etkazilgandan so'ng, teng miqdorda fenol (TE bilan to'yingan, TE yuqori qatlamda muhrlangan va fenolning pastki qatlami olib tashlangan) qo'shilgan va aralashma yumshoq aralashtiriladi (aralashtirish shart emas) va 12000 rpm tezlikda 3 daqiqa davomida santrifüj qilinadi.1-2 marta takrorlang.

Supernatantni oling, etanol cho'kmasini amalga oshirish uchun 0,1 hajm 3mol/L natriy asetat (pH 5,2) va mutlaq etanolning 2,5 barobar hajmini qo'shing.Tozalangan DNKni tegishli miqdorda TE bilan eritib yuboring, tarkibini o'lchang va foydalanishga tayyorlang (u maqsadli gen strukturasini tahlil qilish, prob tayyorlash va boshqalar uchun ishlatilishi mumkin).

3. Yaxshi kuchaytirish o'ziga xosligi bilan PCRni tiklash

Agar PCR kuchaytirilishining o'ziga xosligi yaxshi bo'lsa, bu PCR mahsulotini oddiy tozalash va tiklashdir.Siz PCR mahsulotiga 50ug / ml proteinaz K qo'shishingiz mumkin, 1 soat davomida 37 daraja, fenol / xloroform bilan bir marta ekstrakt, xloroform bilan bir marta ekstrakt va supernatantning 0,1 hajmini qo'shishingiz mumkin.Natriy asetat 2,5 hajm mutlaq etanol bilan cho'ktirish orqali olinadi.

Tegishli mahsulotlar:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/