An'anaviy teskari transkriptazalar yuqori haroratga toqat qila olmaydi (MMLV faolligi uchun optimal harorat 37-50 ° S, AMV esa 42-60 ° S).Murakkabroq virusli RNKni past haroratlarda cDNKga samarali tarzda teskari transkripsiya qilib bo'lmaydi, natijada aniqlash samaradorligi pasayadi.An'anaviy RT-qPCR odatda ikkita asosiy fermentning (teskari transkriptaza va DNK polimeraza) ishtirokini talab qiladi, bu esa reaktsiya tizimining ishlashini soddalashtirish va xarajatlarni kamaytirishni imkonsiz qiladi.Bu erda biz ikkita yuqori haroratga chidamli teskari transkriptazalarni TtH va RevTaq bilan tanishtiramiz.Bu ikki ferment DNK polimeraza vazifasini ham bajaradi, shuning uchun ular bifunksional fermentlar deb ataladi.

TtH DNK polimeraza

Siz termofil Thermus thermophilus HB8 bakteriyasidan olingan TtH haqida eshitgan bo'lsangiz kerak.Mg2+ kabi ikki valentli kationlar mavjudligida u DNK polimeraza faolligiga ega.U Taq fermenti kabi PCR reaktsiyalarida keng qo'llaniladi, ammo u Taq fermentiga qaraganda yuqori issiqlikka chidamliligiga ega, shuning uchun u yuqori GC tarkibi shablonlari bilan PCRga yaxshi ta'sir qiladi.

· Bu ferment asosan 3′→5′ eksonukleaza faolligiga va 5′→3′ eksonuklea faolligiga ega emas, shuning uchun uni dideoksi sekvensiyasi uchun ham ishlatish mumkin.

· Bu ferment RTaz faolligiga ega.Mn2+ borligida RTase faolligi kuchayadi.Ushbu xususiyatdan foydalanib, u bir xil naychada, ya'ni bir bosqichli RT-PCRda teskari transkripsiya reaktsiyasini va PCR reaktsiyasini amalga oshirish uchun ishlatilishi mumkin.Biroq, Mn2+ mavjudligida RT-PCR aniqligi yuqori emas.RT faoliyatining rnaase H faolligi bilan hech qanday aloqasi yo'q.

· Tth-DNK polimeraza faolligining oshishi (pH9, optimal +55℃～+70℃, maksimal +95℃) RNKning ikkilamchi tuzilishi bilan bog'liq muammolarni bartaraf etadi.Olingan cDNK Mg2+ ionlari ishtirokida bir xil ferment bilan PCR yordamida kuchaytirilishi mumkin.

· Tth-DNK polimerazasining yuqori haroratlarda teskari transkripsiya va DNK kuchaytirilishini amalga oshirish qobiliyati bu fermentni miqdoriy RT-PCR, klonlash va hujayra va virusli RNKning gen ekspressiyasini tahlil qilish uchun foydali qiladi.
· Tth-DNK polimeraza RT-PCR uchun RNKni 1kb gacha kuchaytirish uchun ishlatiladi.

Xususiyatlari va afzalliklari

T-DNK polimeraza:

• Optimallashtirilgan polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) mahsulot hajmini, RT-PCR reaktsiyasida kamida 1000 bp bo'lishini ta'minlang

• O'zgartirilgan deoksiribonukleozid trifosfatni substrat sifatida qabul qiling

• RNase H faolligi bilan bog'liq emas

• Odatda RNKda mavjud bo'lgan yuqori ikkilamchi tuzilish bilan bog'liq muammolarni bartaraf etish uchun yuqori termal barqarorlikka ega

RevTaq RT-PCR DNK polimeraza

Teskari transkriptaza faolligi bilan issiqlikka chidamli DNK polimeraza

RevTaq-RT-PCR-DNK polimeraza - bu yo'naltirilgan va sun'iy evolyutsiya natijasida olingan teskari transkriptaza va DNK polimeraza faolligiga ega bo'lgan muhandislik, yuqori issiqlikka chidamli, ikki funksiyali ferment.

· 95°C da RevTaq RT-PCR DNK polimerazasining yarimparchalanish davri 40 daqiqadan ortiq.

· RevTaq RT-PCR DNK polimerazasi RNK shablonidan to'g'ridan-to'g'ri yuqori haroratli teskari transkripsiyaga imkon beradi va ko'proq cDNK shablonlarini yaratish uchun teskari transkripsiya bosqichi bir necha marta takrorlanishi mumkin.

· RevTaq RT-PCR DNK polimeraza "nol bosqichli" RT-PCR (izotermik teskari transkripsiya bosqichi yo'q) imkonini beradi, chunki siklik PCR kengayish bosqichida teskari transkripsiya va DNKni kuchaytirish bir vaqtning o'zida sodir bo'ladi.Bu, shuningdek, yuqori haroratlarda teskari transkripsiya reaktsiyasini rag'batlantiradi va shu bilan RNKdagi kuchli ikkilamchi strukturani yuqori haroratlarda eritishda duch keladigan muammolarni kamaytiradi.

· Aptamerga asoslangan issiq ishga tushirish formulasi tufayli RevTaq RT-PCR DNK polimeraza tavlanish va cho'zish harorati 57°C dan yuqori bo'lganda yaxshi natijalar beradi.

· Ferment issiqlikka chidamli bo'lgani uchun, juda yuqori erish nuqtalari (>60 ° C) bo'lgan primerlar va problarni loyihalash tavsiya etiladi.

· Reaksiyani o'rnatish jarayonida harorat gradienti orqali tavlanish/uzaytirish bosqichining haroratini optimallashtirish tavsiya etiladi.

· Harorat qanchalik yuqori bo'lsa, PCRning o'ziga xosligi shunchalik yuqori bo'ladi.Teskari transkripsiya sikli odatda PCR sikliga nisbatan yuqori haroratda amalga oshiriladi, chunki DNK Primer:RNK Andoza gibridizatsiyasi odatda DNK Primer:cDNA Template dupleksiga qaraganda yuqori erish nuqtasiga ega.

· RevTaq RT-PCR DNK polimeraza genetik jihatdan ishlab chiqilgan va optimallashtirilgan bo'lib, amplikon hajmi 60-300 bp orasida.

RevTaq RT-PCR DNK polimerazasini aniqlash chegarasi 4 nusxaga yetadi/

Optimallashtirilgan reaktsiya tizimi (yuqori erish nuqtasi bo'lgan primerlarni o'rnatish) rasmda ko'rsatilgan.RevTaq RT-PCR DNK polimeraza bilan boshqariladigan RT-PCR TaqPath 1 bosqichli RT-qPCR asosiy aralashmasiga qaraganda yaxshiroq sezuvchanlikni va kamroq aniqlangan namunani suyultirish gradientini ko'rsatadi.

Ko'proq afzalliklar:

Tez boshlash funksiyasi → Dastlabki termal denaturatsiya bosqichini o'tkazib yuborish mumkin.

Hot-start aptamer formulasi → Darhol 100% ferment faolligini ta'minlang va past haroratlarda (<57 ° C) o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirishni oldini oling.

Bo'linish funktsiyasi → RNK ekstraktsiya bosqichi o'tkazib yuborilgan, chunki RevTaq RT-PCR DNK polimeraza ham qo'pol reaktsiya namunalarini qayta ishlay oladi.Issiq RT-PCR siklida eukaryotlar, bakteriyalar va viruslarning hujayra membranalarini darhol yo'q qilishi mumkin.

IVD xom ashyo darajasi → yuqori sifat standartlari va juda raqobatbardosh narxlar