• PCR - bu oz miqdordagi DNK shablonidan DNKni kuchaytirish uchun ishlatiladigan usul.RT-PCR keyinchalik kuchaytirilishi mumkin bo'lgan RNK manbasidan DNK shablonini ishlab chiqarish uchun teskari transkripsiyadan foydalanadi.
• PCR va RT-PCR odatda yakuniy nuqta reaktsiyalaridir, qPCR va RT-qPCR esa mavjud shablon miqdorini aniqlash uchun PCR reaktsiyasi paytida mahsulot sintezi tezligining kinetikasidan foydalanadi.
• Raqamli PCR kabi yangi usullar dastlabki DNK shablonini mutlaq miqdoriy aniqlashni ta'minlaydi, izotermik PCR kabi usullar ishonchli natijalarni ta'minlash uchun qimmat uskunalarga bo'lgan ehtiyojni kamaytiradi.

Polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) DNK va RNK ketma-ketligini kuchaytirish va aniqlash uchun nisbatan sodda va keng qo'llaniladigan molekulyar biologiya usulidir.Ko'pincha bir necha kun davom etishi mumkin bo'lgan DNKni klonlash va kuchaytirishning an'anaviy usullari bilan taqqoslaganda, PCR bir necha soatni talab qiladi.PCR juda sezgir va aniq ketma-ketliklarni aniqlash va kuchaytirish uchun minimal shablonni talab qiladi.Asosiy PCR usullari oddiy DNK va RNKni aniqlashdan yanada rivojlangan.Quyida biz tadqiqot ehtiyojlaringiz uchun Enzo Life Sciences-da taqdim etadigan turli xil PCR usullari va reagentlar haqida umumiy ma'lumot berdik.Biz olimlarga keyingi tadqiqot loyihasida foydalanish uchun PCR reagentlariga tezda kirishda yordam berishni maqsad qilganmiz!

PCR

Standart PCR uchun sizga kerak bo'lgan yagona narsa - DNK polimeraza, magniy, nukleotidlar, primerlar, kuchaytiriladigan DNK shabloni va termosikl.PCR mexanizmi o'z maqsadi kabi oddiy: 1) ikki zanjirli DNK (dsDNK) issiqlik bilan denatüratsiyalanadi, 2) primerlar bitta DNK zanjiriga to'g'ri keladi va 3) primerlar DNK polimeraza tomonidan kengaytiriladi, natijada DNKning ikki nusxasi hosil bo'ladi. original DNK zanjiri.Bir qator haroratlar va vaqtlar davomida denaturatsiya, tavlanish va cho'zilish jarayoni kuchaytirilishning bir tsikli deb nomlanadi (1-rasm).

Tsiklning har bir bosqichi ishlatiladigan shablon va primer to'plami uchun optimallashtirilgan bo'lishi kerak.Ushbu tsikl taxminan 20-40 marta takrorlanadi va kuchaytirilgan mahsulotni odatda agaroz jeli yordamida tahlil qilish mumkin (2-rasm).

PCR juda sezgir usul bo'lgani uchun va bitta reaktsiyalar uchun juda kichik hajmlar talab qilinadi, bir nechta reaktsiyalar uchun asosiy aralashmani tayyorlash tavsiya etiladi.Asosiy aralashmani yaxshilab aralashtirish va keyin reaktsiyalar soniga bo'lish kerak, bunda har bir reaksiya bir xil miqdordagi ferment, dNTP va primerlarni o'z ichiga oladi.Enzo Life Sciences kabi ko'plab etkazib beruvchilar, shuningdek, primerlar va DNK shablonidan tashqari hamma narsani o'z ichiga olgan PCR aralashmalarini taklif qilishadi.

Guanin/sitozinga boy (GC ga boy) hududlar standart PCR texnikasida qiyinchilik tug'diradi.GCga boy ketma-ketliklar GC tarkibi pastroq ketma-ketliklarga qaraganda barqarorroq.Bundan tashqari, GCga boy ketma-ketliklar soch turmagi kabi ikkilamchi tuzilmalarni hosil qiladi.Natijada, denaturatsiya bosqichida GCga boy qo'sh iplarni to'liq ajratish qiyin.Binobarin, DNK polimeraza yangi zanjirni to'siqsiz sintez qila olmaydi.Yuqori denaturatsiya harorati buni yaxshilashi mumkin va yuqori tavlanish harorati va qisqaroq tavlanish vaqtiga o'zgartirishlar GCga boy primerlarning noaniq bog'lanishini oldini oladi.Qo'shimcha reagentlar GCga boy ketma-ketlikni kuchaytirishi mumkin.DMSO, glitserin va betain GC o'zaro ta'siridan kelib chiqadigan ikkilamchi tuzilmalarni buzishga yordam beradi va shu bilan er-xotin iplarni ajratishni osonlashtiradi.

Hot Start PCR

Noma'lum kuchaytirish - bu PCR paytida yuzaga kelishi mumkin bo'lgan muammo.PCR uchun ishlatiladigan ko'pgina DNK polimerazalari 68 ° C dan 72 ° C gacha bo'lgan haroratlarda yaxshi ishlaydi.Biroq, ferment pastroq haroratlarda ham faol bo'lishi mumkin, ammo pastroq.Yuvish haroratidan ancha past haroratlarda primerlar o'ziga xos bo'lmagan tarzda bog'lanishi va hatto reaktsiya muz ustida o'rnatilgan bo'lsa ham o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirilishiga olib kelishi mumkin.Buni ma'lum bir haroratga erishilgandan so'ng DNK polimerazadan ajralib chiqadigan polimeraza inhibitörleri yordamida oldini olish mumkin, shuning uchun issiq start PCR atamasi.Inhibitor polimerazni bog'laydigan va denaturatsiyaning boshlang'ich haroratida (odatda 95 ° C) denaturatsiya qiluvchi antikor bo'lishi mumkin.

Yuqori aniqlikdagi polimeraza

DNK polimerazalari asl shablon ketma-ketligiga nisbatan aniq kuchayishiga qaramasdan, nukleotidlarni moslashtirishda xatolar yuzaga kelishi mumkin.Klonlash kabi ilovalardagi nomuvofiqliklar transkriptlarning kesilishiga va quyi oqimda noto'g'ri tarjima qilingan yoki faol bo'lmagan oqsillarga olib kelishi mumkin.Ushbu nomuvofiqliklarga yo'l qo'ymaslik uchun "tekshirish" faolligiga ega polimerazalar aniqlandi va ish jarayoniga kiritildi.Birinchi korrektor polimeraza Pfu 1991 yilda Pyrococcus furiosusda aniqlangan.Ushbu Pfu fermenti 3' dan 5' gacha eksonukleaza faolligiga ega.DNK kuchaytirilganda, ekzonukleaza ipning 3' uchida mos kelmaydigan nukleotidlarni olib tashlaydi.Keyin to'g'ri nukleotid almashtiriladi va DNK sintezi davom etadi.Noto'g'ri nukleotidlar ketma-ketligini aniqlash ferment bilan to'g'ri nukleozid trifosfat bilan bog'lanish yaqinligiga asoslanadi, bu erda samarasiz bog'lanish sintezni sekinlashtiradi va to'g'ri almashtirishga imkon beradi.Pfu polimerazasining tekshirish faoliyati Taq DNK polimeraza bilan solishtirganda yakuniy ketma-ketlikda kamroq xatolarga olib keladi.So'nggi yillarda boshqa tekshiruvchi fermentlar aniqlandi va DNKni kuchaytirish vaqtida xatolik darajasini yanada kamaytirish uchun original Pfu fermentining modifikatsiyalari amalga oshirildi.

RT-PCR

Teskari transkripsiyali PCR yoki RT-PCR, RNKdan shablon sifatida foydalanishga imkon beradi.Qo'shimcha qadam RNKni aniqlash va kuchaytirish imkonini beradi.RNK teskari transkriptaza yordamida komplementar DNKga (cDNK) teskari transkripsiya qilinadi.RNK shablonining sifati va tozaligi RT-PCR muvaffaqiyati uchun juda muhimdir.RT-PCR ning birinchi bosqichi DNK/RNK gibridining sintezidir.Teskari transkriptaza, shuningdek, gibridning RNK qismini buzadigan RNase H funktsiyasiga ega.Keyin bitta zanjirli DNK molekulasi teskari transkriptazaning DNKga bog'liq DNK polimeraza faolligi bilan cDNKga to'ldiriladi.Birinchi zanjir reaktsiyasining samaradorligi kuchaytirish jarayoniga ta'sir qilishi mumkin.Bundan buyon cDNKni kuchaytirish uchun standart PCR protsedurasi qo'llaniladi.RT-PCR yordamida RNKni cDNKga qaytarish imkoniyati juda ko'p afzalliklarga ega va u birinchi navbatda gen ekspressiyasini tahlil qilish uchun ishlatiladi.RNK bir zanjirli va juda beqaror bo'lib, u bilan ishlashni qiyinlashtiradi.U odatda biologik namunadagi RNK transkriptlarini aniqlaydigan qPCRda birinchi qadam bo'lib xizmat qiladi.

qPCR va RT-qPCR

Miqdoriy PCR (qPCR) ko'plab ilovalar uchun nuklein kislotalarni aniqlash, tavsiflash va miqdorini aniqlash uchun ishlatiladi.RT-qPCR da RNK transkriptlari ko'pincha yuqorida aytib o'tilganidek, ularni cDNKga teskari transkripsiya qilish orqali aniqlanadi va keyin qPCR amalga oshiriladi.Standart PCRda bo'lgani kabi, DNK uchta takroriy bosqichda kuchaytiriladi: denatürasyon, tavlanish va cho'zish.Biroq, qPCR da lyuminestsent yorliqlash PCR rivojlanishi bilan ma'lumotlarni to'plash imkonini beradi.Mavjud usullar va kimyoviy moddalar qatori tufayli ushbu texnika juda ko'p afzalliklarga ega.

Bo'yoqqa asoslangan qPCRda (odatda yashil) lyuminestsent yorliqlash dsDNK bog'lovchi bo'yoqdan foydalanish orqali kuchaytirilgan DNK molekulalarining miqdorini aniqlash imkonini beradi.Har bir tsikl davomida floresans o'lchanadi.Floresans signali replikatsiya qilingan DNK miqdoriga mutanosib ravishda ortadi.Demak, DNK miqdori “real vaqtda” aniqlanadi (3-rasm).Bo'yoqqa asoslangan qPCRning kamchiliklari shundaki, bir vaqtning o'zida faqat bitta maqsad tekshirilishi mumkin va bo'yoq namunada mavjud bo'lgan har qanday ds-DNK bilan bog'lanadi.

Zondga asoslangan qPCRda har bir namunada bir vaqtning o'zida ko'plab maqsadlar aniqlanishi mumkin, ammo bu optimallashtirish va primerlarga qo'shimcha ravishda ishlatiladigan maqsadga maxsus zond(lar) ni loyihalashni talab qiladi.Prob konstruksiyalarining bir nechta turlari mavjud, ammo eng keng tarqalgan turi florofor va söndürgichni o'z ichiga olgan gidroliz probidir.Floresan-rezonans energiyasini uzatish (FRET) prob buzilmagan holda söndürücü orqali ftoroforning emissiyasini oldini oladi.Biroq, PCR reaktsiyasi vaqtida prob primerning kengayishi va u bog'langan o'ziga xos ketma-ketlikning kuchayishi paytida gidrolizlanadi.Probning bo'linishi floroforni söndürücüden ajratib turadi va floresansning kuchaytirilishiga bog'liq o'sishiga olib keladi (4-rasm).Shunday qilib, probga asoslangan qPCR reaktsiyasidan olingan floresans signali namunada mavjud bo'lgan zond maqsadli ketma-ketligi miqdoriga proportsionaldir.Zondga asoslangan qPCR bo'yoqqa asoslangan qPCRga qaraganda o'ziga xos bo'lganligi sababli, u ko'pincha qPCR-ga asoslangan diagnostika tahlillarida qo'llaniladigan texnologiyadir.

Izotermik kuchaytirish

Yuqorida aytib o'tilgan PCR texnikasi denatürasyon, tavlanish va kengaytirish bosqichlari uchun kamera haroratini yuqoriga va pastga aniq oshirish uchun qimmatbaho termosikl uskunalarini talab qiladi.Bunday aniq qurilmalarga muhtoj bo'lmagan va oddiy suv hammomida yoki hatto qiziqish hujayralari ichida ham amalga oshirilishi mumkin bo'lgan bir qator texnikalar ishlab chiqilgan.Ushbu usullar birgalikda izotermik kuchaytirish deb ataladi va eksponensial, chiziqli yoki kaskadli kuchaytirishga asoslangan.

Izotermik kuchaytirishning eng mashhur turi loop vositachiligidagi izotermik kuchaytirish yoki LAMP.LAMP shablon DNK yoki RNKni kuchaytirish uchun 65⁰C da eksponensial kuchaytirishdan foydalanadi.LAMPni amalga oshirishda maqsadli DNKning hududlarini to'ldiruvchi to'rtdan oltitagacha primerlar yangi DNKni sintez qilish uchun DNK polimeraza bilan ishlatiladi.Ushbu primerlardan ikkitasi boshqa primerlardagi ketma-ketliklarni taniydigan va ularni bog'laydigan qo'shimcha ketma-ketliklarga ega bo'lib, yangi sintez qilingan DNKda "halqa" strukturasini shakllantirishga imkon beradi, bu esa keyingi amplifikatsiya bosqichlarida primerning tavlanishiga yordam beradi.LAMP floresan, agaroz jel elektroforezi yoki kolorimetriyani o'z ichiga olgan bir nechta usullar bilan ko'rsatilishi mumkin.Kolorimetriya yordamida mahsulot mavjudligi yoki yo‘qligini vizualizatsiya qilish va aniqlashning qulayligi va zarur bo‘lgan qimmat uskunalarning yo‘qligi LAMPni klinik laboratoriya sinovlari oson bo‘lmagan hududlarda SARS-CoV-2 sinovi yoki namunalarni saqlash va tashish uchun mos variantga aylantirdi. amalga oshirish mumkin emas edi yoki ilgari PCR termosikl uskunalari bo'lmagan laboratoriyalarda.