Astar dizayni asosi (99% muammolarni hal qilish mumkin)
1. Astar uzunligi: Darslik 15-30bp, odatda taxminan 20bp talab qiladi.Haqiqiy holat o'ziga xoslikni ta'minlash uchun 18-24bp bo'lishi yaxshiroqdir, lekin qanchalik uzoq bo'lsa, shuncha yaxshi, juda uzun primer ham o'ziga xoslikni kamaytiradi va hosilni kamaytiradi.
2. Primerni kuchaytirish oralig'i: 200-500bp mos keladi va fragmentni muayyan sharoitlarda 10kb gacha kengaytirish mumkin.
3. Primer bazasi: G + C ning tarkibi 40-60% bo'lishi kerak, juda kam G + C kuchaytirish effekti yaxshi emas, juda ko'p G + C o'ziga xos bo'lmagan bantlar paydo bo'lishi oson.ATGC eng yaxshi tasodifiy taqsimlanadi, 5 dan ortiq purin yoki pirimidin nukleotidlarining klasterlaridan qochadi.Barqarorlikni oshirish uchun 5′ uchi va oraliq ketma-ketliklar uchun multi-gc, 3′ uchida boy GC dan saqlaning, oxirgi 3 ta asos uchun GC yo'q yoki oxirgi 5 ta bazadan 3 tasi uchun GC yo'q.
4. Primerlarda ikkilamchi tuzilishga yo'l qo'ymang va ikkita primer o'rtasida, ayniqsa 3 'uchida komplementatsiyadan saqlaning, aks holda primer dimer hosil bo'ladi va o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirilgan bantlar hosil bo'ladi.
5. Primerlarning 3 'uchidagi asoslar, ayniqsa oxirgi va oxirgidan oldingi asoslar, ulanishi yo'q terminal asoslari tufayli PCR ishlamay qolishining oldini olish uchun qat'iy ravishda bog'langan bo'lishi kerak.
6. Primerlar tegishli bo'linish joylariga ega yoki qo'shilishi mumkin va kuchaytirilgan maqsadli ketma-ketlikda tarjixon bo'linish tahlili yoki molekulyar klonlash uchun juda foydali bo'lgan tegishli bo'linish joylari bo'lishi kerak.
7. Primerlarning o'ziga xosligi: primerlar nuklein kislotalar ketma-ketligi ma'lumotlar bazasida boshqa ketma-ketliklar bilan aniq homologiyaga ega bo'lmasligi kerak.
8. Dasturiy ta'minotdan foydalanishni o'rganing: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Ushbu onlayn dizayn eng yaxshi ishlaydi).
Yuqoridagi tarkib astar dizayni muammolarining kamida 99% ni hal qilishi mumkin.
Primer dizayni tafsilotlarini nazorat qilish
1. Astar uzunligi
Umumiy astar uzunligi 18 ~ 30 tayanch.Umuman olganda, primerning tavlanish haroratini belgilovchi eng muhim omil - bu astar uzunligi.Astarning tavlanish harorati odatda tanlanadi (Tm qiymati -5 ℃) va ba'zilari bevosita Tm qiymatidan foydalanadi.Astarlarning tavlanish haroratini taxminiy hisoblash uchun quyidagi formulalardan foydalanish mumkin.
Primer uzunligi 20bp dan kam bo'lsa: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Astar uzunligi 20bp dan katta bo'lsa: 62,3 ℃ + 0,41 ℃ (% GC) -500 / uzunlik-5 ℃
Bundan tashqari, ko'plab dasturiy ta'minot tavlanish haroratini hisoblash uchun ham ishlatilishi mumkin, hisoblash printsipi boshqacha bo'ladi, shuning uchun ba'zan hisoblangan qiymat kichik bo'shliqqa ega bo'lishi mumkin.PCR reaktsiyalarini optimallashtirish uchun eng yaxshi samaradorlik va o'ziga xoslik uchun 54 ℃ dan kam bo'lmagan tavlanish haroratini ta'minlaydigan eng qisqa primerlar qo'llaniladi.
Umuman olganda, primerning o'ziga xosligi har bir qo'shimcha nukleotid uchun to'rt baravar ortadi, shuning uchun ko'pgina ilovalar uchun minimal astar uzunligi 18 nukleotidni tashkil qiladi.Primer uzunligining yuqori chegarasi juda muhim emas, asosan reaktsiya samaradorligi bilan bog'liq.Entropiya tufayli primer qancha uzun bo'lsa, DNK polimeraza bog'lanishi uchun barqaror ikki zanjirli shablonni hosil qilish uchun maqsadli DNK bilan bog'lanish tezligi shunchalik past bo'ladi.
Primerlarni loyihalash uchun dasturiy ta'minotdan foydalanganda, primerlarning uzunligi o'z navbatida TM qiymati bilan aniqlanishi mumkin, ayniqsa flüoresan miqdoriy PCR primerlari uchun TM = 60 ℃ yoki shunga o'xshash nazorat qilinishi kerak.
2.GC tarkibi
Odatda, primer ketma-ketligidagi G + C tarkibi 40% ~ 60% ni tashkil qiladi va bir juft primerning GC tarkibi va Tm qiymati muvofiqlashtirilishi kerak.Agar primer jiddiy GC yoki AT tendentsiyasiga ega bo'lsa, primerning 5 'uchiga tegishli miqdorda A, T yoki G va C quyruq qo'shilishi mumkin.
3. Yuvish harorati
Yuvish harorati zanjirdan ajratilgan haroratdan 5 ℃ past bo'lishi kerak.Agar primer asoslari soni kichik bo'lsa, tavlanish harorati mos ravishda oshirilishi mumkin, bu esa PCRning o'ziga xosligini oshirishi mumkin.Agar tagliklar soni ko'p bo'lsa, tavlanish harorati mos ravishda kamaytirilishi mumkin.4 ℃ ~ 6 ℃ bir juft primer o'rtasidagi tavlanish harorati farqi PCR rentabelligiga ta'sir qilmaydi, lekin ideal holda bir juft primerning tavlanish harorati bir xil bo'lib, 55 ℃ ~ 75 ℃ orasida o'zgarishi mumkin.
4. Kuchaytirish shablonining ikkilamchi tuzilish maydonidan qoching
Kuchaytirilgan fragmentni tanlashda shablonning ikkilamchi tuzilish mintaqasidan qochish yaxshidir.Maqsadli fragmentning barqaror ikkilamchi tuzilishi shablonni tanlash uchun foydali bo'lgan tegishli kompyuter dasturlari tomonidan bashorat qilinishi va baholanishi mumkin.Eksperimental natijalar shuni ko'rsatadiki, kengaytiriladigan hududning erkin energiyasi (△G) 58,6 kJ/mol dan kam bo'lsa, kengayish ko'pincha muvaffaqiyatsiz bo'ladi.
5. Maqsadli DNK bilan mos kelmaslik
Kuchaytirilgan maqsadli DNK ketma-ketligi katta bo'lsa, primer maqsadli DNKning bir nechta qismlariga bog'lanishi mumkin, natijada bir nechta bantlar paydo bo'ladi.Bu safar BLAST dasturiy ta'minot sinovidan foydalanish kerak, veb-sayt:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Ikki ketma-ketlikni tekislash-ni tanlang (bl2seq).
Primer ketma-ketliklarini 1 zonaga va maqsadli DNK ketma-ketliklarini 2 zonaga joylashtirish bir-birini almashtiradi va BLAST komplementar, antisens va boshqa imkoniyatlarni hisoblab chiqadi, shuning uchun foydalanuvchilar ikkala zanjir ham sezuvchanlik zanjiri ekanligini payqashlari shart emas.Agar siz ma'lumotlar bazasidagi ketma-ketlikning GI raqamini bilsangiz, GI raqamini ham kiritishingiz mumkin, shuning uchun ketma-ketlikning katta qismini joylashtirishingiz shart emas.Nihoyat, primerda maqsadli DNKda bir nechta gomologik joylar mavjudligini bilish uchun 3 da Align tugmasini bosing.
6. Primer terminali
Astarning 3 'uchida kengaytma boshlanadi, shuning uchun u erdan mos kelmaslikning oldini olish muhimdir.3 ' uchi ketma-ket 3 G yoki C dan oshmasligi kerak, chunki bu G+C boyitish ketma-ketligi hududida primerning noto'g'ri ishga tushishiga olib keladi.3' uchi hech qanday ikkilamchi tuzilma hosil qila olmaydi, maxsus PCR (AS-PCR) reaktsiyalaridan tashqari, primerning 3' uchi mos kelmasligi mumkin.Misol uchun, agar kodlash hududi kuchaytirilsa, primerning 3' uchi kodonning uchinchi holatida tugatilmasligi kerak, chunki kodonning uchinchi pozitsiyasi degeneratsiyaga moyil bo'lib, bu kuchaytirishning o'ziga xosligi va samaradorligiga ta'sir qiladi.Anneksiya primerlarini ishlatganda, kodon foydalanish jadvaliga qarang, biologik afzalliklarga e'tibor bering, 3′ uchida biriktiruvchi primerlardan foydalanmang va yuqori konsentratsiyali primerlardan (1uM-3uM) foydalaning.
7. Primerlarning ikkilamchi tuzilishi
Astarlarning o'zi bir-birini to'ldiruvchi ketma-ketlikka ega bo'lmasligi kerak, aks holda primerlarning o'zlari soch turmagi tuzilmalariga aylanadi va bu ikkilamchi tuzilma sterik to'siq tufayli primerlar va shablonlarning bog'lanishiga ta'sir qiladi.Agar sun'iy mulohazalar ishlatilsa, primerlarning uzluksiz qo'shimcha asoslari 3bp dan oshmasligi kerak.Ikki primer o'rtasida bir-birini to'ldiruvchi bo'lmasligi kerak, ayniqsa primer dimerlarining shakllanishiga yo'l qo'ymaslik uchun 3 'uchning bir-birini to'ldiruvchi bir-biriga yopishishiga yo'l qo'ymaslik kerak.Umuman olganda, bir juft astar o'rtasida ketma-ket 4 tadan ko'p bo'lmagan asoslar homologiyasi yoki bir-birini to'ldiruvchi bo'lishi kerak.
8. Belgilar yoki joylarni qo'shing
5 'uchi kuchaytirgichning o'ziga xosligiga juda oz ta'sir qiladi va shuning uchun kuchaytirish o'ziga xosligiga ta'sir qilmasdan o'zgartirilishi mumkin.5-sonli primerning modifikatsiyasi quyidagilarni o'z ichiga oladi: fermentlarni cheklash joyini qo'shish;Belgilangan biotin, floresan, digoksin, Eu3+ va boshqalar. Proteinni bog'laydigan DNK ketma-ketligini kiriting;Mutatsiya joylarini kiritish, mutatsiyalar ketma-ketligini kiritish va etishmayotgan va promotor ketma-ketliklarini kiritish va hokazo. Qo'shimcha asoslar ko'proq yoki kamroq kuchaytirish samaradorligiga ta'sir qiladi va primer dimer hosil bo'lish imkoniyatini oshiradi, ammo keyingi bosqich uchun ba'zi imtiyozlar berilishi kerak.Maqsadli ketma-ketlikda mavjud bo'lmagan qo'shimcha ketma-ketliklar, masalan, cheklash joylari va promotorlar ketma-ketligi, o'ziga xoslikka ta'sir qilmasdan, primerning 5' uchiga qo'shilishi mumkin.Ushbu ketma-ketliklar primer Tm qiymatlarini hisoblashda hisobga olinmaydi, lekin ular to'ldiruvchi va ichki ikkilamchi tuzilish uchun sinovdan o'tkazilishi kerak.
9. Subklonlar
Ko'pincha, PCR faqat dastlabki klonlashdir va keyin biz maqsadli fragmentni turli vektorlarga subklonlashimiz kerak, shuning uchun biz PCR bosqichida keyingi operatsiya uchun qo'shimcha asoslarni loyihalashimiz kerak.
Subklonlash uchun mo'ljallangan ba'zi ketma-ketliklar quyida umumlashtiriladi.
Cheklovli endonukleaza cheklash joyi qo'shildi
Fermentlarni cheklash joylarini qo'shish PCR mahsulotlarini subklonlash uchun eng ko'p qo'llaniladigan usuldir.Umuman olganda, bo'linish joyi oltita asosdan iborat bo'lib, 5 'uchiga qo'shimcha ravishda 2 ~ 3 himoya asoslarini qo'shish kerak.Biroq, turli fermentlar tomonidan talab qilinadigan himoya asoslari soni har xil.Misol uchun, SalⅠ himoya asosini talab qilmaydi, EcoRⅤ 1 ta himoya tayanchini, NotⅠ uchun 2 ta himoya asosini va Hind Ⅲ uchun 3 ta himoya asosini talab qiladi.
LIC dumini qo'shadi
LIC ning to'liq nomi Ligation-Independent klonlashdir, bu Navogen tomonidan pET vektorining bir qismi uchun maxsus ixtiro qilingan klonlash usuli.LIC usuli bilan tayyorlangan pET tashuvchisi qo'shimcha bo'lmagan 12-15 ta asosli bitta ipli yopishqoq uchlarga ega bo'lib, ular maqsadli qo'shimcha qismidagi mos keladigan yopishqoq uchlarini to'ldiradi.Kuchaytirish maqsadida kiritilgan fragmentning primer 5' ketma-ketligi LIC vektorini to'ldirishi kerak.T4 DNK polimerazasining 3'→5' ekstranekt faolligi qisqa vaqtdan so'ng kiritilgan fragmentda bitta ipli yopishqoq uchini hosil qilishi mumkin.Mahsulot faqat tayyorlangan insert fragmenti va vektorning o'zaro tavlanishidan hosil bo'lishi mumkinligi sababli, bu usul juda tez va samarali bo'lib, u yo'naltirilgan klonlashdir.
Yo'naltirilgan TA klon quyruq qo'shish
TA klonlash fragmentni vektorga yo'naltira olmadi, shuning uchun keyinchalik Invitrogen klonlashni maqsad qilgan vektorni taqdim etdi, uning bir uchida to'rtta asosiy GTGGS mavjud.Shuning uchun, PCR primerlarini loyihalashda mos ravishda qo'shimcha ketma-ketliklar qo'shilishi kerak, shuning uchun parchalar "yo'naltirilgan" bo'lishi mumkin.
Agar vaqtingiz kam bo'lsa, genni vektor bilan birlashtirib, to'g'ridan-to'g'ri sintezni sinab ko'rishingiz mumkin, biz buni mushakshunoslarda ET gen sintezi deb ataymiz.
D. In-Fusion klonlash usuli
Ligaza kerak emas, uzoq reaktsiya talab qilinmaydi.Chiziqli vektorning ikkala uchida ketma-ketlik kiritilsa, primerlarni loyihalashda, keyin PCR mahsuloti va chiziqli vektor BSA o'z ichiga olgan termoyadroviy ferment eritmasiga qo'shiladi va yarim soat davomida xona haroratida joylashtiriladi, transformatsiyani amalga oshirish mumkin.Bu usul, ayniqsa, katta hajmli konvertatsiya qilish uchun javob beradi.
10. Primerni birlashtirish
Ba'zan, primer dizayni haqida faqat cheklangan ketma-ketlik ma'lumotlari ma'lum.Misol uchun, agar faqat aminokislotalar ketma-ketligi ma'lum bo'lsa, birlashtiruvchi primerni loyihalash mumkin.Birlashma primeri - bu bitta aminokislotani kodlaydigan barcha turli xil asos imkoniyatlarini ifodalovchi turli xil ketma-ketliklarning aralashmasi.O'ziga xoslikni oshirish uchun siz turli organizmlarning asosiy foydalanish afzalliklariga ko'ra anneksiyani kamaytirish uchun kodon foydalanish jadvaliga murojaat qilishingiz mumkin.Astarning tavlanish haroratini kamaytirish uchun gipoksantin barcha asoslar bilan birlashtirilishi mumkin.Primerning 3′ uchida biriktirilgan asoslardan foydalanmang, chunki 3′ uchidagi oxirgi 3 ta asosning tavlanishi PCRni noto'g'ri joyda boshlash uchun etarli.Yuqori primer konsentratsiyasi (1mkM dan 3mkM gacha) qo'llaniladi, chunki ko'plab qo'shimcha aralashmalardagi primerlar maqsadli shablonga xos emas.
PCR xom ashyosiboshqaruv
1. Primer miqdori
Har bir primerning konsentratsiyasi 0,1 ~ 1umol yoki 10 ~ 100pmol.Eng kam miqdordagi primer bilan kerakli natijani ishlab chiqarish yaxshiroqdir.Primerning yuqori konsentratsiyasi mos kelmasligi va o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirilishiga olib keladi va primerlar o'rtasida dimerlarni hosil qilish imkoniyatini oshiradi.
2. Primer konsentratsiyasi
Primerlarning kontsentratsiyasi o'ziga xoslikka ta'sir qiladi.Optimal primer konsentratsiyasi odatda 0,1 dan 0,5 mkM gacha.Yuqori primer konsentratsiyasi o'ziga xos bo'lmagan mahsulotlarning kuchayishiga olib keladi.
3. Primerning tavlanish harorati
Astarlar uchun yana bir muhim parametr - erish harorati (Tm).Bu primerlar va komplementar ketma-ketliklarning 50% ikki zanjirli DNK molekulalari sifatida ifodalangan haroratdir.PCR tavlanish haroratini o'rnatish uchun Tm talab qilinadi.Ideal holda, tavlanish harorati maqsadli ketma-ketlik bilan primerlarning samarali tavlanishini ta'minlash uchun etarlicha past, lekin nonspesifik bog'lanishni kamaytirish uchun etarlicha yuqori.O'rtacha tavlanish harorati 55 ℃ dan 70 ℃ gacha.Tozalash harorati odatda primer Tm dan 5 ℃ pastroq o'rnatiladi.
Tm ni o'rnatish uchun bir nechta formulalar mavjud bo'lib, ular ishlatiladigan formulaga va primerlar ketma-ketligiga qarab katta farq qiladi.Ko'pgina formulalar taxminiy Tm qiymatini ta'minlaganligi sababli, barcha tavlanish harorati faqat boshlang'ich nuqtadir.O'ziga xoslikni tavlanish haroratini bosqichma-bosqich oshiradigan bir nechta reaktsiyalarni tahlil qilish orqali yaxshilash mumkin.Taxminiy Tm-5℃ ostida boshlang va asta-sekin yumshatish haroratini 2 ℃ ga oshiring.Yuqori tavlanish harorati primer dimerlari va o'ziga xos bo'lmagan mahsulotlarning shakllanishini kamaytiradi.Eng yaxshi natijalarga erishish uchun ikkita primer taxminan Tm qiymatlariga ega bo'lishi kerak.Agar primer juftlarining Tm farqi 5℃ dan ortiq bo'lsa, astarlar tsiklda pastroq tavlanish haroratidan foydalangan holda sezilarli noto'g'ri boshlashni ko'rsatadi.Ikki primer Tm boshqacha bo'lsa, tavlanish haroratini eng past Tm dan 5℃ pastroq qilib qo'ying.Shu bilan bir qatorda, o'ziga xoslikni oshirish uchun, birinchi navbatda, yuqori Tm uchun mo'ljallangan tavlanish haroratida beshta tsikl, so'ngra past Tm uchun mo'ljallangan tavlanish haroratida qolgan tsikllar bajarilishi mumkin.Bu qiyin sharoitlarda maqsad shablonining qisman nusxasini olish imkonini beradi.
4. Primerning tozaligi va barqarorligi
Maxsus primerlarning standart tozaligi ko'pchilik PCR ilovalari uchun etarli.Tuzsizlantirish yo'li bilan benzoil va izobutilil guruhlarini olib tashlash minimaldir va shuning uchun PCRga xalaqit bermaydi.Ba'zi ilovalar sintez jarayonida to'liq bo'lmagan ketma-ketliklarni olib tashlash uchun tozalashni talab qiladi.Ushbu kesilgan ketma-ketliklar DNK sintezi kimyosining samaradorligi 100% bo'lmaganligi sababli yuzaga keladi.Bu dumaloq jarayon bo'lib, takroriy kimyoviy reaktsiyalardan foydalanadi, chunki har bir asos DNKni 3' dan 5' gacha hosil qilish uchun qo'shiladi.Ikkala tsiklda ham muvaffaqiyatsiz bo'lishingiz mumkin.Uzunroq primerlar, ayniqsa 50 dan ortiq asoslar, kesilgan ketma-ketliklarning katta qismiga ega va tozalashni talab qilishi mumkin.
Primerlarning rentabelligiga sintetik kimyo va tozalash usulining samaradorligi ta'sir qiladi.Sitologiya va Shengong kabi biofarmatsevtika kompaniyalari oligonukleozidning umumiy chiqishini ta'minlash uchun minimal OD birligidan foydalanadilar.Maxsus astarlar quruq kukun shaklida jo'natiladi.Yakuniy konsentratsiya 100 mkM bo'lishi uchun primerlarni TEda qayta eritish yaxshidir.TE deionizatsiyalangan suvdan yaxshiroqdir, chunki suvning pH darajasi ko'pincha kislotali bo'lib, oligonukleozidlarning gidrolizlanishiga olib keladi.
Astarlarning barqarorligi saqlash sharoitlariga bog'liq.Quruq kukun va erigan primerlar -20 ℃ da saqlanishi kerak.TEda 10 mkM dan yuqori konsentratsiyalarda erigan primerlar 6 oy davomida -20 ℃ da barqaror saqlanishi mumkin, lekin faqat xona haroratida (15 ℃ dan 30 ℃ gacha) 1 haftadan kamroq vaqt davomida saqlanishi mumkin.Quruq kukunli primerlar -20 C da kamida 1 yil va xona haroratida (15 C dan 30 C gacha) 2 oygacha saqlanishi mumkin.
5. Fermentlar va ularning konsentratsiyasi
Hozirgi vaqtda ishlatiladigan Taq DNK polimeraza asosan koliform bakteriyalar tomonidan sintez qilingan gen muhandislik fermentidir.Oddiy PCR reaktsiyasini katalizlash uchun zarur bo'lgan ferment miqdori taxminan 2,5 U (100ul umumiy reaktsiya hajmini bildiradi).Agar kontsentratsiya juda yuqori bo'lsa, bu o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirilishiga olib kelishi mumkin;konsentratsiya juda past bo'lsa, sintetik mahsulot miqdori kamayadi.
6. dNTP ning sifati va kontsentratsiyasi
dNTP sifati PCR amplifikasiyasining kontsentratsiyasi va samaradorligi bilan chambarchas bog'liq.dNTP kukuni donador bo'lib, noto'g'ri saqlangan bo'lsa, uning o'zgaruvchanligi biologik faolligini yo'qotadi.dNTP eritmasi kislotali bo'lib, yuqori konsentratsiyada, uning PH ni 7,0 ~ 7,5 ga sozlash uchun 1M NaOH yoki 1M Tris.HCL bufer eritmasi bilan, oz miqdorda pastki o'rash, -20 ℃ da muzlatilgan holda ishlatilishi kerak.Ko'p muzlatish eritish dNTPni yomonlashtiradi.PCR reaktsiyasida dNTP 50 ~ 200umol / L bo'lishi kerak.Ayniqsa, to'rtta DNTPS kontsentratsiyasiga e'tibor qaratish lozim (teng mol tayyorlash).Agar ulardan birortasining kontsentratsiyasi boshqalardan farq qilsa (yuqori yoki past), nomuvofiqlik yuzaga keladi.Juda past konsentratsiya PCR mahsulotlarining hosildorligini pasaytiradi.dNTP Mg2+ bilan birikishi va erkin Mg2+ konsentratsiyasini kamaytirishi mumkin.
7. Shablon (maqsadli gen) nuklein kislotasi
Shablon nuklein kislotasining miqdori va tozalanish darajasi PCRning muvaffaqiyati yoki muvaffaqiyatsizligi uchun asosiy bo'g'inlardan biridir.An'anaviy DNKni tozalash usullari odatda namunalarni hazm qilish va yo'q qilish uchun SDS va proteaz K dan foydalanadi.SDS ning asosiy vazifalari quyidagilardan iborat: hujayra membranasida lipidlar va oqsillarni eritib yuboradi, shu bilan membrana oqsillarini eritib hujayra membranasini yo'q qiladi va hujayradagi yadro oqsillarini dissotsiatsiyalaydi, SDS ham oqsillar bilan birlashishi va cho'kma hosil qilishi mumkin;Proteaz K oqsillarni, ayniqsa DNK bilan bog'langan gistonlarni gidrolizlashi va hazm qilishi, so'ngra oqsillarni va boshqa hujayra komponentlarini olish uchun organik erituvchi fenol va xloroformdan foydalanishi va nuklein kislotani cho'ktirish uchun etanol yoki izopropil spirtini ishlatishi mumkin.Chiqarilgan nuklein kislota PCR reaktsiyalari uchun shablon sifatida ishlatilishi mumkin.Umumiy klinik aniqlash namunalari uchun hujayralarni eritish, patogenlarni lizatlash, oqsillarni xromosomalardan erkin maqsadli genlargacha hazm qilish va olib tashlash uchun tez va oddiy usuldan foydalanish mumkin va to'g'ridan-to'g'ri PCR kuchaytirilishi uchun ishlatiladi.RNK shablonini ekstraktsiya qilish odatda RNase ning RNKni parchalanishini oldini olish uchun guanidin izotiyosiyanat yoki proteaz K usulidan foydalanadi.
8.Mg2+ konsentratsiyasi
Mg2+ PCR kuchaytirilishining o'ziga xosligi va rentabelligiga sezilarli ta'sir ko'rsatadi.Umumiy PCR reaktsiyasida, turli xil dNTP kontsentratsiyasi 200umol / L bo'lsa, Mg2 + ning tegishli konsentratsiyasi 1,5 ~ 2,0 mmol / L ni tashkil qiladi.Mg2+ kontsentratsiyasi juda yuqori, reaksiyaning o'ziga xosligi pasayadi, o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirilish sodir bo'ladi, juda past konsentratsiya Taq DNK polimeraza faolligini pasaytiradi, natijada reaktsiya mahsulotlari kamayadi.
Magniy ionlari PCRning bir necha jihatlariga ta'sir qiladi, masalan, hosilga ta'sir qiluvchi DNK polimeraza faolligi;Yana bir misol - o'ziga xoslikka ta'sir qiluvchi primer tavlanishi.dNTP va shablon magniy ioniga bog'lanib, ferment faolligi uchun zarur bo'lgan erkin magniy ionining miqdorini kamaytiradi.Optimal magniy ioni kontsentratsiyasi turli primer juftlari va shablonlari uchun farq qiladi, lekin 200 mkM dNTP bilan odatiy PCR boshlang'ich kontsentratsiyasi 1,5 mM (eslatma: real vaqtda miqdoriy PCR uchun floresan zond bilan 3 dan 5 mm gacha magniy ioni eritmasidan foydalaning).Erkin magniy ionlarining yuqori konsentratsiyasi rentabellikni oshiradi, ammo o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirgichni oshiradi va aniqlikni pasaytiradi.Optimal kontsentratsiyani aniqlash uchun magniy ionlari titrlash 0,5 mM dan 1 mM dan 3 mM gacha bo'lgan bosqichlarda amalga oshirildi.Magniy ionini optimallashtirishga bog'liqlikni kamaytirish uchun Platinum Taq DNK polimerazasidan foydalanish mumkin.Platinum Taq DNK polimeraza Taq DNK polimerazadan ko'ra kengroq magniy ionlari kontsentratsiyasida funktsiyani saqlab turishga qodir va shuning uchun kamroq optimallashtirishni talab qiladi.
9. Pcrni rag'batlantiruvchi qo'shimchalar
Ko'pgina shablonlarning yuqori o'ziga xos kuchaytirilishi uchun tavlanish harorati, primer dizayni va magniy ioni kontsentratsiyasini optimallashtirish etarli;ammo, ba'zi shablonlar, jumladan, yuqori GC tarkibiga ega bo'lganlar, qo'shimcha choralarni talab qiladi.DNKning erish haroratiga ta'sir qiluvchi qo'shimchalar mahsulotning o'ziga xosligi va hosildorligini yaxshilashning yana bir usulini ta'minlaydi.Eng yaxshi natijalarga erishish uchun shablonni to'liq denatüratsiya qilish kerak.
Bundan tashqari, ikkilamchi struktura primerni bog'lash va ferment kengayishiga to'sqinlik qiladi.
PCR qo'shimchalari, jumladan formamid, DMSO, glitserin, betain va PCRx Enhancer Solution, kuchaytirishni kuchaytiradi.Ularning mumkin bo'lgan mexanizmi erish haroratini pasaytirish, shu bilan primerlarning tavlanishiga yordam berish va ikkilamchi tuzilish hududi orqali DNK polimeraza kengayishiga yordam berishdir.PCRx Solution boshqa afzalliklarga ega.Platinum Taq DNK polimeraza va Platinum Pfx DNK polimeraza bilan foydalanilganda minimal magniy ionini optimallashtirish talab qilinadi.Shunday qilib, Platinum texnikasi uchinchi yondashuv, magniy ionini optimallashtirishga bog'liqlikni kamaytirish bilan birga o'ziga xoslikni oshirish uchun qo'shimcha bilan birlashtiriladi.Eng yaxshi natijalarga erishish uchun qo'shimchalarning konsentratsiyasini optimallashtirish kerak, ayniqsa Taq DNK polimerazasini inhibe qiluvchi DMSO, formamid va glitserin.
10. Issiq boshlash
Hot start PCR yaxshi primer dizayniga qo'shimcha ravishda PCR o'ziga xosligini yaxshilashning eng muhim usullaridan biridir.Taq DNK polimerazasining optimal cho'zilish harorati 72 ℃ bo'lsa ham, polimeraza xona haroratida faol bo'lib qoladi.Shunday qilib, o'ziga xos bo'lmagan mahsulotlar PCR reaktsiyasini tayyorlash paytida va termal tsiklning boshida ushlab turish harorati tavlanish haroratidan past bo'lganda ishlab chiqariladi.Shakllanganidan so'ng, bu o'ziga xos bo'lmagan mahsulotlar samarali ravishda kuchaytiriladi.Hot-start PCR, ayniqsa, primer dizayni uchun ishlatiladigan saytlar genetik elementlarning joylashuvi bilan cheklangan bo'lsa, ayniqsa samarali bo'ladi, masalan, saytga yo'naltirilgan mutatsiyalar, ekspress klonlash yoki DNK muhandisligi uchun ishlatiladigan genetik elementlarni qurish va manipulyatsiya qilish.
Taq DNK polimeraza faolligini cheklashning umumiy usuli muz ustida PCR reaktsiyasi eritmasini tayyorlash va uni oldindan qizdirilgan PCR apparatiga joylashtirishdir.Bu usul oddiy va arzon, lekin u fermentning faoliyatini yakunlamaydi va shuning uchun o'ziga xos bo'lmagan mahsulotlarning kuchayishini to'liq bartaraf etmaydi.
Termal astarlash DNK sintezini PCR apparati denatürasyon haroratiga etgunga qadar muhim komponentni inhibe qilish orqali kechiktiradi.Ko'pgina qo'lda termal boshlash usullari, shu jumladan Taq DNK polimerazasining kechiktirilgan qo'shilishi, ayniqsa yuqori o'tkazuvchanlik ilovalari uchun noqulaydir.Boshqa termal astarlash usullari magniy ionlari yoki fermentlarni o'z ichiga olgan muhim komponentni yopish yoki shablonlar va tamponlar kabi reaktiv komponentlarni jismoniy izolyatsiya qilish uchun mum qalqoni ishlatadi.Termal aylanish jarayonida turli komponentlar chiqariladi va mum erishi bilan aralashtiriladi.Qo'lda ishlaydigan issiq ishga tushirish usuli singari, mum qalqoni usuli ham og'ir va ifloslanishga moyil va yuqori o'tkazuvchanlik ilovalari uchun mos emas.
Platina DNK polimeraza avtomatik hot start PCR uchun qulay va samarali hisoblanadi.Platinum Taq DNK polimeraza Taq DNK polimeraza qarshi monoklonal antikor bilan birlashtirilgan rekombinant Taq DNK polimerazadan iborat.Antikorlar uzoq vaqt haroratni ushlab turish paytida ferment faolligini inhibe qilish uchun PCR tomonidan ishlab chiqilgan.Taq DNK polimeraza denaturatsiya bosqichining 94 ℃ izolyatsiyasi paytida reaksiyaga chiqarilib, polimeraza faolligini to'liq tikladi.Termal boshlash uchun kimyoviy modifikatsiyalangan Taq DNK polimerazasidan farqli o'laroq, Platinum fermenti polimerazani faollashtirish uchun 94 ℃ (10 dan 15 minutgacha) uzoq muddatli izolyatsiyani talab qilmaydi.PlatinumTaq DNK polimeraza bilan Taq DNK polimeraza faolligining 90% 94 ℃ da 2 daqiqadan so'ng tiklandi.
11. Nest-PCR
Ichki primerlar yordamida ketma-ket kuchaytirish davrlari o'ziga xoslik va sezgirlikni oshirishi mumkin.Birinchi tur - 15 dan 20 tsiklgacha bo'lgan standart kuchaytirish.Dastlabki kuchaytirish mahsulotining kichik bir qismi 100 dan 1000 marta suyultirildi va 15 dan 20 tsiklga qadar kuchaytirishning ikkinchi bosqichiga qo'shildi.Shu bilan bir qatorda, dastlabki kuchaytirilgan mahsulot jelni tozalash orqali o'lchanishi mumkin.Kuchaytirishning ikkinchi bosqichida ichki o'rnatilgan primer ishlatiladi, u birinchi primer ichidagi maqsadli ketma-ketlikka bog'lanishi mumkin.Ichki PCR dan foydalanish bir nechta maqsadli saytlarni kuchaytirish imkoniyatini kamaytiradi, chunki ikkala primer to'plamini to'ldiruvchi bir nechta maqsadli ketma-ketliklar mavjud.Xuddi shu primerlar bilan bir xil umumiy tsikllar soni (30 dan 40 gacha) o'ziga xos bo'lmagan joylarni kuchaytirdi.Ichki PCR cheklangan maqsadli ketma-ketliklarning sezgirligini oshiradi (masalan, noyob mrnalar) va qiyin PCRSning o'ziga xosligini yaxshilaydi (masalan, 5′ RACE).
12. Pastga tushadigan PCR
Pastga tushadigan PCR PCR ning dastlabki bir necha tsikllari uchun qattiq tavlanish shartlaridan foydalangan holda o'ziga xoslikni yaxshilaydi.Tsikl taxminiy Tm dan taxminan 5 ℃ yuqori yumshatish haroratida boshlanadi, keyin tavlanish harorati Tm 5 ℃ dan past bo'lgunga qadar har bir tsikl 1 ℃ dan 2 ℃ gacha kamayadi.Faqat eng yuqori homologiyaga ega bo'lgan maqsad shablonlari kuchaytiriladi.Ushbu mahsulotlar keyingi davrlarda kengayishda davom etadi va kuchaytirilgan o'ziga xos bo'lmagan mahsulotlarni siqib chiqaradi.Pastga tushadigan PCR primer va maqsad shablonlari o'rtasidagi homologiya darajasi noma'lum bo'lgan usullar uchun foydalidir, masalan, AFLP DNK barmoq izini.
Tegishli PCR to'plamlari
2 × PCR qahramoniTMMix tizimi oddiy PCR Mix tizimiga qaraganda PCR ingibitorlariga nisbatan yuqori tolerantlikka ega va turli xil murakkab shablonlarning PCR kuchaytirilishi bilan osonlikcha bardosh bera oladi.Noyob reaktsiya tizimi va yuqori samarali Taq Hero PCR reaktsiyasini yuqori kuchaytirish samaradorligi, o'ziga xosligi va sezgirligiga ega qiladi.
Yuqori kuchaytirish samaradorligi
U 5'→3' DNK polimeraza faolligiga va 5'→3' ekzonukleaza faolligiga ega, 3'→5' ekzonukleaza faolligisiz.
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I to'plami
Maxsus - optimallashtirilgan bufer va issiq ishga tushirish Taq fermenti o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirish va primer dimer shakllanishini oldini oladi
Yuqori sezuvchanlik - shablonning past nusxalarini aniqlay oladi
To'plamda noyob Foregene teskari transkripsiya reagenti va Foregene HotStar Taq DNK Polimerazasi noyob reaktsiya tizimi bilan birgalikda kuchaytirilishi samaradorligini va reaktsiyaning o'ziga xosligini samarali yaxshilash uchun foydalanadi.
Xabar berish vaqti: 2023 yil 09-may
