RNase - bu sezgir so'z bo'lib, uni tez-tez RNK olish tajribalarini o'tkazadigan ko'plab talabalar eshitishni xohlamaydilar.To'liq qurollangan holda, nihoyat juda zaharli reagentlar fenol va xloroform bilan ekstraksiya qilingan RNK parchalandi.Men yarashmadim!!!Bugun mashhur Rnasening kelib chiqishini ko'rib chiqamiz.

Ribonukleaza (RNase) yoki RNase - bu RNKni kichik molekulalarga gidrolizlashi mumkin bo'lgan nukleaza.RNase, kichik molekula oqsili sifatida, juda barqaror .An'anaviy yuqori harorat va yuqori bosimli bug 'sterilizatsiyasi va oqsil inhibitörleri uni butunlay inaktivatsiya qila olmaydi.RNase ning barqarorligi asosan strukturadagi disulfid aloqalaridan kelib chiqadi.Misol uchun, sigir oshqozon osti bezining keng tarqalgan ishlatiladigan RNase atigi 124 aminokislotadan iborat, ammo 4 ta disulfid aloqasi mavjud.Oltingugurt aloqasi va disulfid aloqasi RNasega mukammal termal barqarorlikni beradi.Bundan tashqari, rnase nisbatan kichik molekulyar og'irlikka ega va ko'p hollarda o'zining dastlabki konformatsiyasini tezda tiklashi mumkin.

Juda barqaror bo'lishdan tashqari,RNazalar laboratoriyada hamma joyda mavjud .RNase biologik himoya mexanizmidir.Hujayra uchun ekzogen RNK ko'pincha o'limga olib keladi.Ekzogen DNK bilan solishtirganda, ekzogen RNK ko'pincha xavfliroqdir.RNK baxtli tarzda transkripsiyalanadi va tarjima qilinadi, shuning uchun deyarli barcha organizmlar ekzogen RNKning ishg'olidan himoya qilish uchun RNazalarni ishlab chiqdilar.Shuning uchun, laboratoriyada o'stirilgan bakterial hujayralar va siz RNKni ajratib olganingiz RNaz aromasini chiqaradi.Inson tanasi suyuqliklari (tupurik, ko'z yoshlari va boshqalar) ko'p miqdorda RNazni o'z ichiga oladi, shuning uchun RNK parchalanganda yig'lamang.Qanchalik ko'p yig'lasangiz, RNK degradatsiyasi shunchalik yomonlashadi!!Daiyu opa RNKni olish uchun mos emas!

Bundan tashqari, sizning nozik teringiz juda ko'p RNase ni o'z ichiga oladi va teri tegib ketgan markerlar, pipetkalar, muzlatgich eshiklari va eshik tutqichlarida ham RNase mavjud.

Shunchalik shov-shuv bilan, keling, RNases bilan qanday kurashishni ko'rib chiqaylik.

RNKni olib tashlashda hamma o'ylaydigan birinchi narsaDEPC(dietil pirokarbonat).DEPC asosan gistidin RNase faol guruhining imidazol halqasi bilan birlashib, oqsilni denatüratsiya qiladi va shu bilan ferment faolligini inhibe qiladi.0,1% DEPC Rnasega yaxshiroq olib tashlash ta'siriga ega bo'lishi mumkin, ammo biz DEPC ma'lum kanserogen ekanligiga e'tibor qaratishimiz kerak, shuning uchun uni ishlatishda alohida e'tibor berilishi kerak.

RNase uchun biz ikki jihatdan boshlashimiz kerak,birinchisi, endogen RNaz faolligini inhibe qilishdir

Trizol tarkibidagi guanidin izotiyosiyanat va DTT kabi an'anaviy RNK ekstraktsiya reagentlari RNase ning disulfid bog'lanishini ochishi mumkin, ammo hali ham ba'zi RNazalar mavjud, ayniqsa to'qimalar namunalarida, shuning uchun past haroratga e'tibor bering.

1.To'qima namunasini olib chiqqandan so'ng darhol suyuq azotga yoki RNKni saqlash uchun tijorat eritmasiga botiring.

2.Hujayra namunasining RNKsini ajratib olgandan so'ng, uni lizis eritmasiga qo'shing va muz qutisiga lizing.

3. Maydalash uchun suyuq azotdan foydalanish yaxshidir to'qimalar namunalari homogenlashtirilganda.Suyuq azotsiz elektr gomogenizatordan foydalanilganda, gomogenat adapterini to'liq oldindan sovutishga e'tibor bering.

Ikkinchisi ekzogen DNase

1.To'liq qurollangan bo'ling, laboratoriya xalatini taqing, niqob taqing va yangi qo'lqop kiying (unchalik tejamkor bo'lmang! Shuni ta'kidlash kerakki, Trizol o'ta korroziydir va u qo'lqop orqali ham juda kuchli, shuning uchun qo'llaringizga tomizmang).

2.Barcha ishlatilgan pipetka uchlari, EP naychalari, PCR naychalari va boshqa jihozlar de-RNase bilan ishlov berilishi kerak.Uni 0,1% DEPCda namlash va keyin yuqori bosim ostida bosim o'tkazish mumkin.Tutun qopqog'ida ishlashga e'tibor bering.Mahalliy zolimlar fermentlarni olib tashlash uchun to'g'ridan-to'g'ri sarf materiallarini sotib olishlari mumkin.

PS: Sizga dangasa usulni aytib beraman.Yuqori harorat va yuqori bosim RNazni butunlay olib tashlay olmasa ham, uning katta qismini olib tashlaydi.2 marta yuqori harorat va yuqori bosim yaxshi ta'sir ko'rsatadi va RNKning ekstraktsiyasi kam ta'sir qiladi.

3.Spirtli ichimliklar oqsillarni denatüratsiya qilishi mumkin,shuning uchun RNK ekstraktsiya jadvalini 75% spirt bilan artib tashlash mumkin , va qo'lqoplar ham spirtli ichimliklar bilan püskürtülebilir.

4.Yakuniy RNKni erituvchi eritma va santrifüj trubkasi ham de-RNaz bilan ishlov berilishi kerak.DEPC suvi keng tarqalgan ishlatiladigan RNKni erituvchi eritmadir.Keling, DEPC suvini to'g'ri tayyorlash usuli haqida gapiraylik (sotib olayotganda tijorat DEPC-ni qayta qadoqlashni unutmang)

DEPC ni 1:1000 o'ta toza suvga qo'shing, yaxshilab silkiting, 37 ° C da bir kechada turing va 15 daqiqa davomida yuqori harorat va yuqori bosim ostida 121 ° C da sterilizatsiya qiling.DEPC suvini -20°C da 1 ml alikvotlarda saqlash mumkin.

Nihoyat, xulosa qilish uchun: past harorat - bu kalit, sarf materiallari yaxshi ishlov beriladi, to'liq qurollangan va kamroq gapiradi!

Xo'sh, bu bugungi strategiya uchun.Siz aytgan barcha RNK konsentratsiyasi va poklik tilayman.A260/A280 ikkalasi ham 2.0!!!

Albatta, agar siz axona haroratida ishlash RNK ​​ekstraktsiyasi to'plami, yuqoridagi muammolarga duch kelmasligingiz mumkin.

Xona haroratida ishlash, DNase qo'shmasdan, 11 daqiqada hujayralardan umumiy RNKni ajratib oladi va 30 daqiqada hayvonlar to'qimalari yoki o'simliklaridan umumiy RNK ajratib oladi.

Sinov namunalari uchun quyidagi manzilga murojaat qiling:overseas@foregene.com

Tegishli mahsulotlar:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/