Floresan miqdoriy PCR (shuningdek, TaqMan PCR, bundan keyin FQ-PCR deb ataladi) 1995 yilda Qo'shma Shtatlarda PE (Perkin Elmer) tomonidan ishlab chiqilgan yangi nuklein kislota miqdoriy texnologiyasidir. Bu texnologiya floresan yorliqli problarni qo'shish orqali an'anaviy PCRga asoslangan.Moslashuvchan PCR bilan solishtirganda, FQ-PCR o'zining miqdoriy funktsiyasini amalga oshirish uchun juda ko'p afzalliklarga ega.Ushbu maqola texnologiyaning xarakteristikalari, tamoyillari, usullari va qo'llanilishini qisqacha ta'riflamoqchi.
1 Xususiyatlar
FQ-PCR nafaqat oddiy PCRning yuqori sezuvchanligiga ega, balki flüoresan zondlarni qo'llaganligi sababli, u an'anaviy PCRning ko'plab kamchiliklarini bartaraf etadigan miqdoriy natijalarni olish uchun fotoelektr o'tkazuvchanlik tizimi orqali PCR kuchaytirish paytida lyuminestsent signalning o'zgarishini to'g'ridan-to'g'ri aniqlay oladi, shuning uchun u DNKning yuqori o'ziga xos xususiyatiga ega.
Masalan, umumiy PCR mahsulotlarini agaroz gel elektroforezi va etidiy bromidni ultrabinafsha nurlar bilan bo'yash yoki poliakrilamid gel elektroforezi va kumush bilan bo'yash orqali kuzatish kerak.Bu nafaqat bir nechta asboblarni talab qiladi, balki vaqt va kuch talab qiladi.Etidium bromidi ishlatilgan dog'lar inson tanasi uchun zararli va bu murakkab eksperimental protseduralar ifloslanish va noto'g'ri pozitivlar uchun imkoniyatlar yaratadi.Biroq, FQ-PCR namunani yuklash vaqtida faqat bir marta qopqoqni ochishi kerak va keyingi jarayon butunlay yopiq trubkali operatsiya bo'lib, bu PCRdan keyingi ishlov berishni talab qilmaydi, an'anaviy PCR operatsiyalarida ko'plab kamchiliklardan qochadi.Tajriba odatda PE kompaniyasi tomonidan ishlab chiqilgan ABI7100 PCR termal tsiklidan foydalanadi.
Asbob quyidagi xususiyatlarga ega: ① Keng qo'llanilishi: U DNK va RNK PCR mahsulot miqdorini aniqlash, gen ekspressiyasini o'rganish, patogenni aniqlash va PCR sharoitlarini optimallashtirish uchun ishlatilishi mumkin.② Noyob miqdoriy printsip: floresan yorliqli zondlardan foydalangan holda, floresans miqdori lazer qo'zg'alishidan so'ng PCR tsikli bilan to'planadi, natijada miqdoriy aniqlash maqsadiga erishiladi.③ Yuqori ish samaradorligi: O'rnatilgan 9600 PCR termal tsikli, 96 ta namunani avtomatik va sinxron ravishda kuchaytirish va miqdorini aniqlash uchun kompyuter 1 dan 2 soatgacha boshqariladi.④ Jel elektroforeziga ehtiyoj yo'q: namunani suyultirish va elektroforez qilishning hojati yo'q, faqat reaktsiya trubkasida aniqlash uchun maxsus zonddan foydalaning.⑤Quvurda ifloslanish yo'q: noyob to'liq yopiq reaksiya trubkasi va fotoelektr o'tkazuvchanlik tizimi qabul qilingan, shuning uchun ifloslanish haqida tashvishlanishga hojat yo'q.⑥Natijalar takrorlanishi mumkin: miqdoriy dinamik diapazon besh darajagacha.Shu sababli, ushbu texnologiya muvaffaqiyatli ishlab chiqilganligi sababli, u ko'plab ilmiy tadqiqotchilar tomonidan qadrlangan va ko'plab sohalarda qo'llanilgan.
2 Tamoyil va usullar
FQ-PCR ning ishlash printsipi PCR reaktsiya tizimiga floresan yorliqli zondni qo'shish uchun Taq fermentining 5'→3' ekzonukleaza faolligidan foydalanishdir.Zond primer ketma-ketligidagi DNK shabloni bilan maxsus gibridlanishi mumkin.Zondning 5' uchi flüoresan emissiya geni FAM (6-karboksifloressen, 518 nm da flüoresan emissiya cho'qqisi) bilan, 3' uchi esa TAMRA floresan söndürme guruhi (6-karboksitetrametilrodamin, flüoresans emissiyasi 38 nm) bilan belgilangan. PCR amplifikasiyasi vaqtida probning uzaytirilishining oldini olish uchun fosforlangan.Prob butunligicha qolsa, söndürme guruhi emissiya guruhining floresan emissiyasini bostiradi.Emissiya guruhi söndürme guruhidan ajratilgandan so'ng, inhibisyon ko'tariladi va 518nm optik zichlik oshadi va floresan aniqlash tizimi tomonidan aniqlanadi.Renaturatsiya bosqichida zond shablon DNK bilan gibridlanadi va kengaytma fazasidagi Taq fermenti DNK template kengaytmasi bilan birga harakatlanadi.Prob uzilganda, söndürme effekti chiqariladi va floresan signal chiqariladi.Har safar shablon nusxa ko'chirilganda, lyuminestsent signalning chiqishi bilan birga zond kesiladi.Chiqarilgan floroforlar soni va PCR mahsulotlari soni o'rtasida birma-bir bog'liqlik mavjud bo'lganligi sababli, bu usul shablonni aniq aniqlash uchun ishlatilishi mumkin.Eksperimental asbob odatda PE kompaniyasi tomonidan ishlab chiqilgan ABI7100 PCR termal siklatoridan foydalanadi va boshqa termal tsiklerlardan ham foydalanish mumkin.Agar tajriba uchun ABI7700 reaksiya tipidagi reaktsiya tizimi ishlatilsa, reaktsiya tugagandan so'ng, miqdoriy natijalar to'g'ridan-to'g'ri kompyuter tahlili orqali berilishi mumkin.Agar siz boshqa termal tsikllardan foydalansangiz, RQ+, RQ-, △RQ ni hisoblash uchun bir vaqtning o'zida reaksiya trubkasidagi floresans signalini o'lchash uchun flüoresans detektoridan foydalanishingiz kerak.RQ+ namuna trubasining lyuminestsent emissiya guruhining luminesans intensivligining söndürme guruhining lyuminestsent intensivligiga nisbatini ifodalaydi, RQ- bo'sh trubadagi ikkalasining nisbatini ifodalaydi, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) lyuminestsent ma'lumotlarning o'zgarishi natijasida olingan lyuminestsent jarayonlarning hajmini bildiradi.Floresan zondlarning kiritilishi tufayli tajribaning o'ziga xosligi sezilarli darajada yaxshilanadi.Prob dizayni odatda quyidagi shartlarga javob berishi kerak: ①Bog'lashning o'ziga xosligini ta'minlash uchun prob uzunligi taxminan 20-40 tayanch bo'lishi kerak.②Yagona nukleotidlar ketma-ketligini takrorlashning oldini olish uchun GC asoslarining tarkibi 40% dan 60% gacha.③ Gibridlanishdan saqlaning yoki primerlar bilan bir-biriga yopishib oling.④ Prob va shablon o'rtasidagi bog'lanishning barqarorligi primer va shablon o'rtasidagi bog'lanish barqarorligidan kattaroqdir, shuning uchun probning Tm qiymati astarning Tm qiymatidan kamida 5 ° C yuqori bo'lishi kerak.Bundan tashqari, probning kontsentratsiyasi, zond va shablon ketma-ketligi o'rtasidagi homologiya va prob va primer orasidagi masofa eksperimental natijalarga ta'sir qiladi.
Tegishli mahsulotlar:
Xitoy Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman ishlab chiqaruvchi va yetkazib beruvchi |Foregene (foreivd.com)
Yuborilgan vaqt: 2021-yil 15-oktabr
