Real Time PCR, shuningdek miqdoriy PCR yoki qPCR sifatida ham tanilgan, PCR kuchaytiruvchi mahsulotlarni real vaqt rejimida kuzatish va tahlil qilish usulidir.
Kantitativ PCR oddiy operatsiya, tez va qulay, yuqori sezuvchanlik, yaxshi takrorlanuvchanlik va past ifloslanish darajasining afzalliklariga ega bo'lganligi sababli, u tibbiy testlarda, dori samaradorligini baholashda, gen ifodasini tadqiq qilishda, transgenik tadqiqotlarda, genlarni aniqlashda, patogenni aniqlashda keng qo'llaniladi, hayvonlar va o'simliklarni aniqlash., oziq-ovqat sinovlari va boshqa sohalar.
Shuning uchun, siz hayot fanlari bo'yicha fundamental tadqiqotlar bilan shug'ullanasizmi yoki farmatsevtika kompaniyalari, chorvachilik kompaniyalari, oziq-ovqat kompaniyalari xodimlari yoki hatto kirish-chiqish inspektsiyasi va karantin byurolari, atrof-muhit monitoringi bo'limlari, kasalxonalar va boshqa bo'linmalarning xodimlari bo'lasizmi, siz ko'proq yoki kamroq ta'sir qilasiz Yoki miqdoriy PCRni o'zlashtirish bilimlarini bilishingiz kerak.

Real Time PCR printsipi

Real Time PCR - bu PCR reaktsiyasi tizimiga floresan moddalar qo'shiladigan usul bo'lib, PCR reaktsiyasi jarayonida floresans signalining intensivligi miqdoriy PCR asbobi tomonidan real vaqtda nazorat qilinadi va nihoyat, eksperimental ma'lumotlar tahlil qilinadi va qayta ishlanadi.

【Kuchaytirish egri chizig'i】PCR ning dinamik jarayonini tavsiflovchi egri chiziqdir.PCR ning kuchaytirish egri chizig'i aslida standart eksponensial egri chiziq emas, balki sigmasimon egri chiziqdir.

[Amplifikatsion egri chizig'ining platforma bosqichi]PCR tsikllari sonining ko'payishi, DNK polimerazasining inaktivatsiyasi, dNTP va primerlarning kamayishi va qo'shimcha mahsulot pirofosfat reaktsiyasi bilan sintez reaktsiyasini inhibe qilish va boshqalar bilan PCR har doim ham eksponent ravishda kengaymaydi., va oxir-oqibat platoga kiradi.

[Amplifikasiya egri chizig'ining eksponentsial o'sish mintaqasi]Plato fazasi juda katta farq qilsa-da, kuchaytirish egri chizig'ining eksponentsial o'sish mintaqasining ma'lum bir hududida, takroriylik juda yaxshi, bu PCRning miqdoriy tahlili uchun juda muhimdir.

[Eshik qiymati va Ct qiymati]Biz floresansni aniqlashning chegara qiymatini kuchaytirish egri chizig'ining eksponensial o'sish sohasidagi tegishli pozitsiyasiga, ya'ni chegara qiymatini (threshold) o'rnatamiz.Chegara qiymati va kuchaytirish egri chizig'ining kesishishi Ct qiymatidir, ya'ni Ct qiymati chegara qiymatiga erishilganda aylanishlar sonini (Treshold Cycle) bildiradi.

Quyidagi grafikda chegara chizig'i va kuchaytirish egri chizig'i, pol va Ct qiymati o'rtasidagi bog'liqlik aniq ko'rsatilgan.

【Qanday qilib miqdorni aniqlash mumkin?】

Matematik nazariya bilan isbotlanganki, Ct qiymati boshlang'ich shablonlar sonining logarifmi bilan teskari chiziqli munosabatga ega.Real Time PCR PCR kuchaytirish mahsulotlarini real vaqtda kuzatib boradi va eksponentsial kuchaytirish bosqichida ularning miqdorini aniqlaydi.

PCR ning har bir tsikli uchun DNK eksponent ravishda 2 marta oshdi va tez orada platoga yetdi.

Boshlang'ich DNK miqdori A deb faraz qiling₀ , n sikldan keyin DNK mahsulotining nazariy miqdori quyidagicha ifodalanishi mumkin:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Keyin, boshlang'ich DNK miqdori A 0 qanchalik ko'p bo'lsa, kuchaytirilgan mahsulot miqdori tezroq An aniqlash qiymatiga etadi va An ga yetganda sikllar soni Ct qiymatiga teng bo'ladi.Ya'ni, boshlang'ich DNK miqdori A 0 qancha ko'p bo'lsa, kuchaytirilish egri chizig'i shunchalik erta cho'qqilarga chiqadi va shunga mos ravishda zarur bo'lgan tsikllar soni n kichikroq bo'ladi.

Biz ma'lum konsentratsiyali standartni gradient suyultiramiz va uni Real Time PCR uchun shablon sifatida ishlatamiz va DNK miqdorini ko'proqdan kamroqgacha boshlash tartibida teng oraliqlarda bir qator kuchaytirish egri chiziqlari olinadi.Ct qiymati va boshlang'ich shablonlar sonining logarifmi o'rtasidagi chiziqli munosabatga ko'ra, a[standart egri chiziq] yaratilishi mumkin.

Noma'lum konsentratsiyali namunaning Ct qiymatini standart egri chiziqqa almashtirish orqali noma'lum konsentratsiyali namunaning dastlabki shablon miqdorini olish mumkin, bu Real Time PCRning miqdoriy printsipi hisoblanadi.

Real Time PCRni aniqlash usuli

Real Time PCR reaktsiya tizimidagi floresan intensivligini aniqlash orqali PCR kuchaytiruvchi mahsulotlarni aniqlaydi.

Floresan bo'yoqlarni joylashtirish usuli printsipi】

Floresan bo'yoqlari, masalan, TB Green ® , PCR tizimlarida ikki zanjirli DNKga nonspesifik ravishda bog'lanishi va bog'langanda floresan chiqishi mumkin.

Reaksiya tizimidagi floresans intensivligi PCR davrlarining ortishi bilan eksponent ravishda oshdi.Floresans intensivligini aniqlash orqali reaktsiya tizimidagi DNK kuchaytirilishining miqdori real vaqtda kuzatilishi mumkin, so'ngra namunadagi boshlang'ich shablon miqdori teskari baholanishi mumkin.

【Floresan zond usulining printsipi】

lyuminestsent prob5′ uchida floresan guruhi va 3′ uchida söndürme guruhi bo'lgan nuklein kislotalar ketma-ketligi bo'lib, shablonga maxsus bog'lanishi mumkin.Prob buzilmagan bo'lsa, florofor tomonidan chiqarilgan floresans söndürme guruhi tomonidan o'chiriladi va floresan qila olmaydi.Prob parchalanganda, floresan modda ajralib chiqadi va floresans chiqaradi.

PCR reaktsiyasi eritmasiga floresan prob qo'shiladi.Yuvish jarayonida lyuminestsent prob shablonning o'ziga xos holatiga bog'lanadi.Kengaytma jarayonida PCR fermentining 5'→3' eksonukleaza faolligi shablon bilan gibridlangan floresan probni parchalashi mumkin va floresan moddasi floresan chiqarish uchun dissotsiyalanadi.Reaksiya tizimida probning floresans intensivligini aniqlash orqali PCR mahsulotining kuchaytirilish miqdorini kuzatish maqsadiga erishish mumkin.

【Flüoresansni aniqlash usulini tanlash】

Agar u yuqori homologiyaga ega ketma-ketliklarni ajratish va SNP tiplash tahlili kabi multipleks PCR aniqlashni amalga oshirish uchun ishlatilsa, lyuminestsent prob usuli almashtirib bo'lmaydi.
Boshqa Real Time PCR tajribalari uchun oddiy, oson va arzon lyuminestsent kimera usulidan foydalanish mumkin.

probesKuchli o'ziga xoslik, multipleks PCRga qodir

Kamchilik

Kuchaytirish uchun yuqori o'ziga xoslik talablari;

multipleks PCRni amalga oshirib bo'lmaydi.Muayyan zondlarni loyihalash kerak, yuqori narx;

ba'zan prob dizayni qiyin

Tegishli mahsulotlar: