Hamma qRT-PCR eksperimenti printsipi, primer dizayni, natijalarni talqin qilish va boshqalar haqida gapiradi, lekin men siz bilan qRT-PCR ning eksperimental ishlashini baham ko'rishim kerak deb o'ylayman.Bu kichik, lekin natijalar haqida.

QRT-PCR qilishdan oldin, biz o'z RNK va ishlash usullarini aniq tushunishimiz kerak.Zero, bizning harakatlarimiz shunchaki mashq qilishdan ko'ra, natijaga erishishga qaratilgan.Shunday qilib, qRT-PCR qilishdan oldin, biz quyidagi muammolarni aniqlashimiz kerak (ulardan ba'zilari faqat SYBR uchun amal qiladi).

1 Sizning RNKingiz buzilmaganiga ishonchingiz komilmi?

NanoDrop 2000 faqat RNK kontsentratsiyasi va tozaligini aniqlay oladi, lekin RNKning yaxlitligini aniqlay olmaydi.

RNK (RNK Intesity Number) qiymati Agilent 2100 Bioanalyzer tizimi tomonidan aniqlangan RNKning yaxlitligini aks ettirishi mumkin.

Rasm. Turli RNK namunalari (eukariotlar) uchun RIN qiymatlarining sxematik diagrammasi

Biroq, laboratoriyalarda odatda Agilent 2100 Bioanalyzer mavjud emas.Bunday holda, biz formaldegid jeli orqali aniqlay olamiz, ammo RNKning umumiy miqdoriga bo'lgan talab yuqori, shuning uchun eng tezkor usul oddiy gel elektroforezidan foydalanishdir.Nukleazsiz muhitda bo'lish talab etiladi, shuning uchun elektroforez idishini, eritma shishasini, jel braketini va taroqni DEPC suvi bilan yuvish kerak.Agaroza ham nukleazsiz (yangi ochilgan bo'lsa) va Yuklash tamponini iloji boricha yangi, 1,2% gel bilan ochish kerak.

E'tibor bering, jel to'liq eritilishi kerak, aks holda rasmdagi 9-namunada ko'rsatilganidek, bir hil bo'lmagan tasmalar paydo bo'ladi.Agar kuchlanish juda yuqori bo'lsa yoki juda uzoq vaqt ishlasa, issiqlik hosil qiladi va RNK degradatsiyasiga olib keladi, shuning uchun kuchlanish va vaqtni oqilona nazorat qilish kerak.Bundan tashqari, jelni ishlatish namunada DNK qoldig'i bor-yo'qligini qo'shimcha ravishda aniqlashi va tarqatish qudug'ida ko'p miqdorda saqlanib qolgan chiziqlar mavjudligini kuzatishi mumkin.

Rasm.RNKning jel elektroforezini aniqlash

2 cDNK kontsentratsiyasiga ishonchingiz komilmi?

Laboratoriyadagi katta birodarlar tajribasi shundan iboratki, har bir inversiya natijasida olingan 20 ul tizimining cDNKsi to'g'ridan-to'g'ri 20X, post-doktorlik opa-singillari esa 10X suyultiriladi.Men odatda vaziyatga bog'liqman.Har bir inson tomonidan aytib o'tilgan RNKning sifati har xil bo'lgani uchun, teskari aylanish darajasi ham har xil va teskari texnologiya barqaror bo'lmasligi mumkin.

Shunday qilib, har safar teskari cDNKni olganimda, avval uni taxminan 3 marta suyultiraman va keyin RT-PCR qilish uchun uy xo'jaligi genidan foydalanaman, tsikllar soni odatda 25 tsiklni tashkil qiladi, o'ziga xos konsentratsiyani aniqlash va so'ngra yakuniy suyultirish omilini aniqlash.

3 Astarlaringizdan foydalanish osonligiga ishonchingiz komilmi?

U qRT-PCR ning erish egri chizig'idan o'tishi mumkin, ammo bu hali ham pul talab qiladi.Ko'p pulga ega bo'lmagan laboratoriyalar uchun ular juda ko'p primerlarni olishganda, ular oddiy RT-PCRdan foydalanib, bu bitta tarmoqli yoki yo'qligini aniqlashlari va primerlarning o'ziga xosligini aniqlashlari mumkin.Agar laboratoriyada pul kam bo'lmasa, barcha primerlarning o'ziga xosligi erish egri chizig'i orqali bir marta aniqlanishi mumkin.

4 Tajriba sharoitlaringiz mos ekanligiga ishonchingiz komilmi?

SYBR kuchli yorug'likdan himoyalangan bo'lishi kerak, shuning uchun SYBR reagentini qo'shganda yuqoridagi yorug'likni o'chirishga harakat qiling va uni bajarish uchun faqat xira yorug'likdan foydalaning.

SYBR ni 4 ° C haroratda saqlang.Ishlatilganda, ko'pik paydo bo'lmasligi uchun yaxshilab aralashtirish uchun sekin yuqoriga va pastga aylantiring va kuchli vorteks qilmang.

Ba'zi opa-singillar namunalarni aralashtirib yuborishdan qo'rqib, PCR taxtasida belgilar chizishni yaxshi ko'radilar, bu noto'g'ri.Sizning markerlaringiz lyuminestsent signallar to'plamiga ta'sir qilishi mumkinligi sababli, quyida ko'rsatilganidek, men odatda o'smirlarga xotiraga yordam berish uchun eksperimental daftarlardan foydalanishni tavsiya qilaman.

Rasm.qRT-PCR namunasini yuklash diagrammasi

5 To'g'ri qilayotganingizga ishonchingiz komilmi?

Qo'lqop kiyish, qo'lqop kiyish, qo'lqop kiyish va muhim narsalarni uch marta aytishni unutmang.

SYBR ning yorug'lik ta'sirini kamaytirish uchun men shaxsan quyidagi rasmda ko'rsatilganidek, avval shablonni qo'shishni yaxshi ko'raman.Tajribaga ko'ra, kichik miqdordagi shablonni qo'shish, ehtimol, namuna olish xatolariga olib kelishi mumkin.Shuning uchun, oz miqdordagi shablonni qo'shish natijasida yuzaga keladigan xatoni minimallashtirish uchun men odatda namunani yana ikki baravar oshiraman va qo'shilgan H2O2 miqdorini kamaytirish uchun namunani qo'shganda miqdorni ikki baravar oshiraman.

Rasm.qRT-PCR yuklashning sxematik diagrammasi

Keyin qRT-PCR tizimini quyidagicha sozlang.

Rasm.qRT-PCR tizimini tayyorlash diagrammasi

QAYD: Konfiguratsiya jarayoni muz ustida bajarilishi kerak.

Namuna qo'shgandan so'ng, shaffof plomba plyonkasini yopishtiring.Qo'llaringiz bilan shaffof plomba plyonkasi yuzasiga tegmaslikka harakat qiling, shunchaki plyonkaning har ikki tomonidagi bo'sh joydan ishlang.Chunki barmoq izlari lyuminestsent signallarni yig'ishga ham ta'sir qilishi mumkin.Keyin namunani devorga osib qo'ymaslik uchun 10 soniya davomida past tezlikda tez santrifüj qilish uchun santrifugadan foydalaning.

Tegishli mahsulotlar:

Cell Direct RT-qPCR to'plami

RT Easy II