Aniqlanishning o'ziga xosligi
Ko'pgina hollarda, primer dizaynining maqsadi PCRning o'ziga xosligini maksimal darajada oshirishdir.Bu ko'plab o'zgaruvchilarning ko'proq yoki kamroq prognoz qilinadigan ta'siri bilan belgilanadi.Muhim o'zgaruvchilardan biri primerning 3' uchidagi ketma-ketlikdir.
Muhimi, o'ziga xoslik uchun mo'ljallangan PCR tahlillari keng dinamik diapazonda yuqori samaradorlikni saqlab qolish ehtimoli ko'proq, chunki tahlil o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirish mahsulotlarini ishlab chiqarmaydi va shu bilan PCR reagentlari bilan raqobatlashadi yoki asosiy kuchaytirish reaktsiyasini inhibe qiladi.
Albatta, ba'zi hollarda o'ziga xoslik eng muhimi emas, masalan, maqsad yaqindan bog'liq, ammo turli patogenlarni miqdoriy aniqlash bo'lsa, maxsus dizayn, optimallashtirish va tekshirish standartlari talab qilinadi.
Erish egri chizig'i amplikonlarning o'ziga xosligini baholashning standart usuli bo'lib, hech bo'lmaganda bitta nishonni kuchaytirish kerakmi yoki yo'qmi nuqtai nazaridan.Ammo shuni ta'kidlash kerakki, erish egri chiziqlari noto'g'ri bo'lishi mumkin, chunki ular, masalan, suboptimal primerlarning kombinatsiyalangan ta'siri va past shablon kontsentratsiyasiga ta'sir qilishi mumkin.
P5 |Erish chizig'i ikkita maqsadli DNKning turli miqdorini ikkita aniqlash natijasida olingan Tm siljishlarini ko'rsatadi.
A. Yuqori konsentratsiyalarda (ad)), qPCR o'lchovi tugagandan so'ng, aniq primer dimer yo'q.Shablon kontsentratsiyasi 50 nusxaga (e) pasayganda, o'ziga xos bo'lmagan mahsulot paydo bo'la boshlaydi va eng past konsentratsiyada (f) yagona mahsulotga aylanadi.
B. Sinov barcha maqsadli konsentratsiyalarda bir xil Tmsni qayd etdi va eng past konsentratsiyada ham (5 nusxada) aniq primer dimer yo'q edi.Ushbu ikkita aniqlash usulidan foydalanganda, NTClarda kuchaytiruvchi mahsulotlar aniqlanmadi.
P5 shablon turli konsentratsiyalarda mavjud bo'lgan namunalar bilan olingan erish egri chiziqlarini ko'rsatadi.P 5a shuni ko'rsatadiki, ikkita eng past konsentratsiyada ishlab chiqarilgan o'ziga xos bo'lmagan kuchaytiruvchi mahsulotlarning Tms o'ziga xos amplikonlarga qaraganda past bo'ladi.
Shubhasiz, bu aniqlash usuli past konsentratsiyalarda mavjud bo'lgan maqsadlarni aniqlash uchun ishonchli tarzda qo'llanilmaydi.
Qizig'i shundaki, NTClar, ya'ni umuman DNKga ega bo'lmagan namunalar (nospesifik) kuchaytiruvchi mahsulotlarni qayd etmagan, bu fon genomik DNKning o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirilishi/polimerizatsiyada ishtirok etishi mumkinligini ko'rsatadi.
Ba'zida bunday fon primerlari va o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirishni bartaraf etish mumkin emas, lekin ko'pincha har qanday shablon konsentratsiyasi va NTC (P 5b) da o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirishga ega bo'lmagan aniqlash usulini loyihalash mumkin.
Bu erda hatto maqsadli konsentratsiyaning kuchayishini Cq 35 bilan qayd etish ham ma'lum bir erish egri chizig'ini hosil qiladi.Xuddi shunday, NTClar ham o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirish belgilarini ko'rsatmadi.Ba'zida aniqlash xatti-harakati ona suyuqlikka bog'liq bo'lishi mumkin va faqat turli Mg2 + kontsentratsiyasi bilan bog'liq bo'lishi mumkin bo'lgan ba'zi bufer kompozitsiyalarida o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirish aniqlanadi.
Aniqlanishning barqarorligi
Ta ni optimallashtirish qPCR aniqlashni empirik tekshirish va optimallashtirish jarayonida foydali qadamdir.U NTC ni kuchaytirmasdan eng past Cq hosil qiluvchi haroratni (yoki harorat oralig'ini) ko'rsatish orqali primer o'rnatilgan mustahkamligini bevosita ko'rsatadi.
Sezuvchanlikdagi ikki-to'rt baravar farq mRNK ifodasi yuqori bo'lgan odamlar uchun muhim bo'lmasligi mumkin, ammo diagnostik testlar uchun bu ijobiy va noto'g'ri salbiy natijalar o'rtasidagi farqni anglatishi mumkin.
qPCR primerlarining Ta xossalari juda katta farq qilishi mumkin.Ba'zi testlar juda mustahkam emas va agar ular primerlarning optimal Ta qiymati ostida bajarilmasa, ular tezda qulab tushadi.
Bu juda muhim, chunki haqiqiy dunyoda bunday aniqlash ko'pincha muammoli bo'lib, namunaning tozaligi, DNK kontsentratsiyasi yoki boshqa DNKning mavjudligi optimal bo'lmasligi mumkin.
Bundan tashqari, maqsadli nusxa soni keng diapazonda o'zgarishi mumkin va reagentlar, plastmassa idishlar yoki asboblar testni o'rnatishda ishlatiladiganlardan farq qilishi mumkin.
P6|Harorat gradienti PCRni aniqlashning turli mustahkamligini ko'rsatadi.
A. Inson miyasi RNK sidan tayyorlangan cDNKda PCR o'tkazish uchun Bioline's Sensifast SYBR mastermiksidan (katalog raqami BIO-98050) foydalaning.
B. Bio-Radning CFX qPCR asbobidan apalenning kuchayish xaritasi va erish egri chizig'ini yozish uchun foydalaning (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. ACSBG1 ning kuchaytirish grafigi va erish egri chizig'i (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. GFAP ning kuchaytirish grafigi va erish egri chizig'i (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCTCGTGGATCTTC).
E. 7C harorat gradienti ostida qayd etilgan Cq farqini ko'rsatadigan turli tavlanish haroratida qayd etilgan Cqs.
P 6 nomaqbul testning odatiy natijasini ko'rsatadi, bunda qPCR 59C va 67C (P 6a) oralig'idagi Tas gradienti yordamida, uchta inson miyasiga xos genlar uchun primerlardan foydalangan holda amalga oshirildi.
Kuchaytirish grafigidan ko'rinib turibdiki, Opalin primerlari idealdan yiroq, chunki ularning optimal Ta diapazoni juda tor (6b-rasm), ya'ni Cq keng tarqalgan, natijada Cqs optimal Cqs Low bilan sezilarli darajada taqqoslanadi.
Ushbu aniqlash usuli beqaror va suboptimal kuchaytirishga olib kelishi mumkin.Shuning uchun, bu primerlar juftligi qayta ishlab chiqilishi kerak.Bundan tashqari, erish egri chizig'i tahlili (inset) shuni ko'rsatadiki, bu aniqlash usulining o'ziga xosligi ham muammoli bo'lishi mumkin, chunki har bir Ta ning erish egri chizig'i boshqacha.
P 6c da ko'rsatilgan ACSBG1ni aniqlash usuli yuqoridagi Opalinni aniqlash usulidan ko'ra mustahkamroq, ammo u hali ham idealdan uzoqdir va uni yaxshilash mumkin.
Biroq, biz mustahkamlik va o'ziga xoslik o'rtasida zaruriy bog'liqlik yo'qligini ta'kidlaymiz, chunki bu aniqlash usuli bilan hosil bo'lgan erish egri chizig'i barcha Tas (inset)da bir xil cho'qqi qiymatini ko'rsatadi.
Boshqa tomondan, mustahkamlik testi ancha bardoshli bo'lib, P 6d da ko'rsatilgan GFAP testida bo'lgani kabi, Tasning keng diapazonida o'xshash Cq larni ishlab chiqaradi.
Xuddi shu 8 daraja Selsiy oralig'ida olingan Cqsdagi farq 1 dan kam bo'lib, eritmaning egri chizig'i (inset) bu harorat oralig'ida aniqlash xususiyatlarini tasdiqlaydi.Shuni ta'kidlash kerakki, hisoblangan Tas va haqiqiy Ta diapazoni juda farq qilishi mumkin.
Tadqiqotchilarga samarali primerlarni loyihalashda yordam berish uchun mo'ljallangan ko'plab ko'rsatmalar mavjud bo'lib, ularning aksariyati uzoq vaqtdan beri belgilangan qoidalarga asoslanadi va primerlarning 3'uchiga katta e'tibor berilgan.Ko'pincha 3' uchida G yoki C ni va ikkita G yoki C asosini (GC qisqichi) kiritish tavsiya etiladi, lekin oxirgi 5 ta bazadan ikkitadan ko'p bo'lmasligi kerak.
Amalda, bu qoidalar tadqiqotchilarga yo'l-yo'riq ko'rsatishi mumkin, ammo ular har qanday sharoitda ham to'g'ri bo'lishi shart emas.
P7 |Primerning 3' uchi o'ziga xoslik yoki samaradorlikka kam ta'sir qiladi.
A. Inson HIF-1a (NM_181054.2) geni uchun primerlarning holati.
B. Oltita sinov elementini kuchaytirish uchun Agilent Brilliant III SYBR Green ona likyoridan (kat. No. 600882) foydalaning.
C. Bio-Radning CFX qPCR asbobi va 3′end primerlari tomonidan qayd etilgan kuchaytirish grafigi va erish egri chizig'i.NTClar qizil rangda ko'rsatilgan.
D. Har bir test elementining Cqs yozuvi
Masalan, P 7 dagi natija 3′end qoidasiga zid keladi.Barcha dizaynlar asosan bir xil natijalarni beradi, faqat ikkita primer kombinatsiyasi NTCda o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirishga olib keladi.
Biroq, biz GC klipining ta'sirini qo'llab-quvvatlay olmaymiz, chunki bu holda A yoki T dan maksimal 30 ta asos sifatida foydalanish o'ziga xoslikni kamaytirmaydi.
F primeri GGCCda tugaydigan C testi NTClarda Cq ni qayd etdi, bu 30-uchida bu ketma-ketliklardan qochish kerakligini ko'rsatdi.Biz primer juftligining eng yaxshi 3′-sonli ketma-ketligini aniqlashning yagona yo'li ba'zi nomzod primerlarni eksperimental ravishda baholash ekanligini ta'kidlaymiz.
Amplifikatsiya samaradorligi
Muhimi, o'ziga xos bo'lmagan PCRni aniqlash hech qachon o'ziga xos bo'lmasa ham, kuchaytirish samaradorligini ferment, ona suyuqlik, qo'shimchalar va aylanish sharoitlarini o'zgartirish orqali turli usullar bilan sozlash va maksimal darajada oshirish mumkin.
PCRni aniqlash samaradorligini baholash uchun maqsadli nuklein kislotadan 10 yoki 5 marta ketma-ket suyultirish, ya'ni "standart egri usuli" dan foydalanish yaxshidir.
Agar standart egri chiziq hosil qilish uchun PCR amplikonlari yoki sintetik DNK maqsadlari ishlatilsa, ushbu nishonlarning ketma-ket suyultirilishi doimiy miqdordagi fon DNK (masalan, genomik DNK) bilan aralashtirilishi kerak.
P8 |PCR samaradorligini baholash uchun suyultirish egri chizig'i.
A. HIF-1 uchun primerlardan foydalaning: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA va R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC va Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (katalog raqami 600882) PCR va erish egri shartlari uchun.
B. 100 ng RNK teskari transkripsiya qilindi, 2 marta suyultirildi va ketma-ket suyultirilgan cDNK namunalari 1 ng inson genomik DNKiga 5 marta suyultirildi.Erish egri chizig'i ichki qismda ko'rsatilgan.
C. RT reaksiyasi, suyultirish va ketma-ket suyultirish ikkinchi cDNK namunasi uchun takrorlandi va natijalar o'xshash edi.
P 8 ikkita turli xil cDNK namunalarida bir xil aniqlash usulidan foydalangan holda ikkita standart egri chiziqni ko'rsatadi, natijada bir xil samaradorlik, taxminan 100% va R2 qiymati ham o'xshash, ya'ni eksperimental ma'lumotlar va regressiya chizig'i o'rtasidagi moslik darajasi yoki ma'lumotlar Chiziqlilik darajasi.
Ikki standart egri taqqoslash mumkin, lekin mutlaqo bir xil emas.Agar maqsad maqsadni aniq aniqlash bo'lsa, shuni ta'kidlash kerakki, noaniqlikni tushuntirmasdan nusxa raqamini hisoblash mumkin emas.
P9 |Standart egri chiziq yordamida miqdorni aniqlash bilan bog'liq o'lchov noaniqligi.
A. PCR va erish egri chizig'i shartlarini bajarish uchun GAPDH (NM_002046) uchun primerlardan foydalaning.F: ACAGTTGCCATGTAGACC va R: TAACTGGTTGAGCACAGG va Bioline'ning Sensifast SYBR mastermix (katalog raqami BIO-98050).
B. Bio-Rad's CFX qPCR asbobida qayd etilgan kuchaytiruvchi diagramma, erish egri chizig'i va standart egri chiziq.
C. Standart egri grafik va 95% ishonch oralig'i (CI).
D. Suyultirish egri chizig'idan olingan uchta Cq qiymatining nusxa raqami va 95% ishonch oralig'i.
P 9 optimallashtirilgan test uchun bitta standart egri chiziqning o'ziga xos o'zgaruvchanligi taxminan 2 marta (95% ishonch oralig'i, minimaldan maksimalgacha) bo'lishini ko'rsatadi, bu kutish mumkin bo'lgan eng kichik o'zgaruvchanlik bo'lishi mumkin.
Tegishli mahsulot:
Mouse Tail Direct PCR to'plami
Animal Tissue Direct PCR to'plami
Yuborilgan vaqt: 2021 yil 30-sentabr
