RT-qPCR oddiy PCR texnologiyasidan ishlab chiqilgan.U an'anaviy PCR reaktsiya tizimiga lyuminestsent kimyoviy moddalarni (lyuminestsent bo'yoqlar yoki lyuminestsent zondlar) qo'shadi va turli xil luminesans mexanizmlariga ko'ra real vaqtda PCR tavlanish va kengaytirish jarayonini aniqlaydi.Muhitdagi lyuminestsent signal o'zgarishlari PCR ning har bir tsiklida mahsulot o'zgarishi miqdorini hisoblash uchun ishlatiladi.Hozirgi vaqtda eng keng tarqalgan usullar floresan bo'yoq usuli va prob usuli hisoblanadi.

Floresan bo'yash usuli:
SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO va boshqalar kabi ba'zi lyuminestsent bo'yoqlar o'z-o'zidan yorug'lik chiqarmaydi, lekin dsDNKning kichik yiviga bog'langandan keyin flüoresans chiqaradi.Shuning uchun, PCR reaktsiyasining boshida mashina floresan signalni aniqlay olmaydi.Reaksiya tavlanish-kengaytma (ikki bosqichli usul) yoki kengayish bosqichiga (uch bosqichli usul) o'tganda, bu vaqtda qo'sh iplar ochiladi va yangi DNK polimeraza Tarmoq sintezi jarayonida floresan molekulalar dsDNA kichik yivida birlashtiriladi va flüoresans chiqaradi.PCR davrlarining soni ortib borayotganligi sababli, ko'proq bo'yoqlar dsDNK bilan birlashadi va floresan signal ham doimiy ravishda kuchayadi.Misol sifatida SYBR Green Ⅰ ni oling.
Tekshirish usuli:
Taqman probi eng ko'p ishlatiladigan gidroliz probidir.Probning 5' uchida floresan guruhi mavjud, odatda FAM.Probning o'zi maqsadli genni to'ldiruvchi ketma-ketlikdir.Flüoroforning 3' uchida lyuminestsent söndürme guruhi mavjud.Floresan-rezonans energiyasini uzatish printsipiga ko'ra (Förster rezonans energiyasini uzatish, FRET), xabarchi floresan guruhi (donor floresan molekulasi) va so'ndiruvchi lyuminestsent guruhi (akseptor floresan molekulasi) qo'zg'alish spektri bir-biriga yopishganda va masofa juda yaqin bo'lganda (7-10 nm floresan floresansi), akseptor molekulasi, avtofluoressensiya esa zaiflashgan.Shuning uchun, PCR reaktsiyasining boshida, zond tizimda bo'sh va buzilmagan bo'lsa, reportyor floresan guruhi floresan nurini chiqarmaydi.Yuvish paytida primer va prob shablonga bog'lanadi.Uzatilish bosqichida polimeraza doimiy ravishda yangi zanjirlarni sintez qiladi.DNK polimeraza 5'-3' ekzonukleaza faolligiga ega.Zondga etib borganida, DNK polimeraza shablondan zondni gidrolizlaydi, reportyor floresan guruhini söndürücü floresan guruhidan ajratadi va lyuminestsent signalni chiqaradi.Prob va shablon o'rtasida birma-bir munosabat mavjud bo'lganligi sababli, prob usuli sinovning aniqligi va sezgirligi bo'yicha bo'yoq usulidan ustundir.

1-rasm qRT-PCR printsipi

Primer dizayni
Printsiplar:

Primerlar nuklein kislotalar seriyasining saqlanib qolgan hududida ishlab chiqilishi va o'ziga xoslikka ega bo'lishi kerak.

cDNK ketma-ketligini ishlatish eng yaxshisidir va mRNK ketma-ketligi ham maqbuldir.Agar yo'q bo'lsa, DNK ketma-ketligining CD mintaqasi dizaynini bilib oling.
Floresan miqdoriy mahsulotning uzunligi 80-150bp, eng uzuni 300bp, primer uzunligi odatda 17-25 tayanch oralig'ida va yuqori va quyi oqim primerlari orasidagi farq juda katta bo'lmasligi kerak.

G+C tarkibi 40% dan 60% gacha, 45-55% esa eng yaxshisidir.
TM qiymati 58-62 daraja orasida.
Primer dimerlari va o'z-o'zidan dimerlardan qochishga harakat qiling, (4 juftdan ko'p ketma-ket to'ldiruvchi asoslar paydo bo'lmaydi) soch turmagi tuzilishi, agar muqarrar bo'lsa, DG<4,5kJ/mol* hosil qiling. Agar siz teskari transkripsiya paytida gDNK olib tashlanganligiga ishonch hosil qila olmasangiz, intronning primerlarini loyihalash yaxshidir. A/G uzluksiz strukturasi (2-3) astar va bo'lmagan
o'ziga xos Geterogen ravishda kuchaytirilgan ketma-ketlikning homologiyasi afzalroq 70% dan kam yoki 8 ta to'ldiruvchi asosiy homologiyaga ega.
Ma'lumotlar bazasi:
Kalit so'zlar bo'yicha CottonFGD qidiruvi
Astar dizayni:
IDT-qPCR primer dizayni

Fig2 IDT onlayn astar dizayn vositasi sahifasi

Shakl 3 natija sahifasi ekrani
lncRNA primerlarining dizayni:
lncRNK:mRNK bilan bir xil qadamlar.
miRNK:Stem-loop usuli printsipi: Barcha miRNKlar taxminan 23 nt qisqa ketma-ketliklar bo'lganligi sababli, to'g'ridan-to'g'ri PCRni aniqlash mumkin emas, shuning uchun stend-loop ketma-ketligi vositasi ishlatiladi.Poyasi-loop ketma-ketligi taxminan 50 nt bo'lgan bir ipli DNK bo'lib, u o'z-o'zidan soch tolasi tuzilishini hosil qilishi mumkin.3 'Oxirgi miRNKning qisman bo'lagini to'ldiruvchi ketma-ketlik sifatida ishlab chiqilishi mumkin, so'ngra maqsadli miRNK teskari transkripsiya paytida ildiz-pastasi ketma-ketligiga ulanishi mumkin va umumiy uzunlik 70bp ga yetishi mumkin, bu qPCR tomonidan aniqlangan kuchaytirilgan mahsulot uzunligiga mos keladi.Tailing miRNK primer dizayni.
Kuchaytirishga xos aniqlash:
Onlayn portlash ma'lumotlar bazasi: ketma-ketlik o'xshashligi bo'yicha CottonFGD portlashi
Mahalliy portlash: Mahalliy portlashni amalga oshirish uchun Blast + dan foydalanishga qarang, Linux va macos to'g'ridan-to'g'ri mahalliy ma'lumotlar bazasini yaratishi mumkin, win10 tizimi ham ubuntu bash o'rnatilgandan keyin amalga oshirilishi mumkin.Mahalliy portlash ma'lumotlar bazasi va mahalliy portlash yaratish;win10 da ubuntu bash-ni oching.
Eslatma: Tog'li paxta va dengiz oroli paxtasi tetraploid ekinlaridir, shuning uchun portlash natijasi ko'pincha ikki yoki undan ortiq gugurt bo'ladi.Ilgari, portlashni amalga oshirish uchun ma'lumotlar bazasi sifatida NAU CD-laridan foydalanish, ehtimol, bir nechta SNP farqlari bilan ikkita gomologik genni topishi mumkin edi.Odatda, ikkita homolog genni primer dizayni bilan ajratib bo'lmaydi, shuning uchun ular bir xil deb hisoblanadi.Agar aniq indel mavjud bo'lsa, primer odatda indelda ishlab chiqilgan, ammo bu primerning ikkilamchi tuzilishiga olib kelishi mumkin Erkin energiya yuqori bo'lib, kuchaytirish samaradorligining pasayishiga olib keladi, ammo bu muqarrar.

Primer ikkilamchi strukturani aniqlash:
Qadamlar:oligo 7 ni oching → kiritish shablonlari ketma-ketligini yoping → pastki oynani yoping → saqlash → shablonda primerni toping, primer uzunligini o'rnatish uchun ctrl+D tugmalarini bosing → o'z-o'zidan dimerizatsiya tanasi, heterodimer, soch qisqichi, mos kelmaslik va boshqalar kabi turli ikkilamchi tuzilmalarni tahlil qiling. 4-rasmdagi oxirgi ikkita rasm primerlarning sinov natijalaridir.Old primerning natijasi yaxshi, aniq dimer va soch turmagi tuzilishi yo'q, uzluksiz qo'shimcha asoslar yo'q va erkin energiyaning mutlaq qiymati 4,5 dan kam, orqa primer esa uzluksiz ko'rsatadi 6 ta asos bir-birini to'ldiruvchi, erkin energiya esa 8,8;bundan tashqari, 3 'uchida jiddiyroq dimer paydo bo'ladi va 4 ta ketma-ket asosli dimer paydo bo'ladi.Erkin energiya yuqori bo'lmasa-da, 3 'dimer Chl kuchaytirishning o'ziga xosligi va kuchaytirish samaradorligiga jiddiy ta'sir qilishi mumkin.Bundan tashqari, soch turmagi, heterodimerlar va mos kelmasligini tekshirish kerak.

Fig3 oligo7 aniqlash natijalari
Kuchaytirish samaradorligini aniqlash:
PCR reaktsiyasining kuchaytirish samaradorligi PCR natijalariga jiddiy ta'sir qiladi.Bundan tashqari, qRT-PCRda kuchaytirish samaradorligi miqdoriy natijalar uchun ayniqsa muhimdir.Reaksiya buferidagi boshqa moddalar, mashinalar va protokollarni olib tashlang.Primerlarning sifati qRT-PCR ni kuchaytirish samaradorligiga ham katta ta'sir ko'rsatadi.Natijalarning aniqligini ta'minlash uchun nisbiy floresans miqdori va mutlaq floresans miqdori primerlarning kuchaytirish samaradorligini aniqlashi kerak.Ma'lumki, samarali qRT-PCR kuchaytirish samaradorligi 85% dan 115% gacha.Ikkita usul mavjud:
1. Standart egri chiziq usuli:
a.cDNKni aralashtiring
b.Gradientni suyultirish
c.qPCR
d.Kuchaytirish samaradorligini hisoblash uchun chiziqli regressiya tenglamasi
2. LinRegPCR
LinRegPCR real vaqtda RT-PCR ma'lumotlarini tahlil qilish dasturi bo'lib, SYBR Green yoki shunga o'xshash kimyoga asoslangan miqdoriy PCR (qPCR) ma'lumotlari deb ham ataladi.Dastur boshlang'ich bo'lmagan tuzatilgan ma'lumotlardan foydalanadi, har bir namuna bo'yicha bazaviy tuzatishni alohida amalga oshiradi, chiziqlilik oynasini aniqlaydi va keyin PCR ma'lumotlar to'plami orqali to'g'ri chiziqni moslashtirish uchun chiziqli regressiya tahlilidan foydalanadi.Ushbu chiziqning qiyaligidan har bir alohida namunaning PCR samaradorligi hisoblanadi.Har bir amplikon uchun o'rtacha PCR samaradorligi va har bir namunadagi Ct qiymati har bir namunadagi boshlang'ich kontsentratsiyani hisoblash uchun ishlatiladi, ixtiyoriy floresan birliklarida ifodalanadi.Ma'lumotlarni kiritish va chiqarish Excel elektron jadvali orqali amalga oshiriladi.Faqat namuna
aralashtirish talab qilinadi, gradient yo'q
qadamlar talab qilinadi:(Misol sifatida Bole CFX96 ni oling, aniq ABIga ega mashina emas)
tajriba:bu standart qPCR tajribasi.
qPCR ma'lumotlarining chiqishi:LinRegPCR chiqish fayllarining ikkita shaklini taniy oladi: RDML yoki miqdorni aniqlash Kuchaytirish natijasi.Aslida, bu mashina tomonidan sikl soni va floresans signalining real vaqtda aniqlash qiymati bo'lib, kuchaytirish chiziqli segment samaradorligining floresan o'zgarishi qiymatini tahlil qilish orqali olinadi.
Ma'lumotlarni tanlash: Nazariy jihatdan, RDML qiymati foydalanish mumkin bo'lishi kerak.Taxminlarga ko'ra, mening kompyuterimning muammosi dasturiy ta'minot RDML ni taniy olmaydi, shuning uchun menda asl ma'lumotlar sifatida Excel chiqish qiymati bor.Avval ma'lumotlarni qo'pol skriningdan o'tkazish tavsiya etiladi, masalan, namunalar qo'shilmagani va hokazo. Chiqish ma'lumotlaridagi nuqtalar o'chirilishi mumkin (albatta, siz ularni o'chira olmaysiz, LinRegPCR keyingi bosqichda ushbu nuqtalarni e'tiborsiz qoldiradi)

5-rasm qPCR ma'lumotlarini eksport qilish

Shakl 6 nomzod namunalarini tanlash

Ma'lumotlarni kiritish:Malaka oshirish natijalarini oching.xls, → LinRegPCR ni oching → fayl → exceldan o‘qing → 7-rasmda ko‘rsatilganidek parametrlarni tanlang → OK → bazalarni aniqlash tugmasini bosing

linRegPCR ma'lumotlarini kiritishning 7-rasm

Natija:Agar takrorlash bo'lmasa, guruhlash shart emas.Agar takrorlash mavjud bo'lsa, guruhlashni namunaviy guruhlashda tahrirlash mumkin va genning nomi identifikatorga kiritiladi va keyin xuddi shu gen avtomatik ravishda guruhlanadi.Nihoyat, faylni bosing, excelni eksport qiling va natijalarni ko'ring.Har bir quduqning kuchaytirish samaradorligi va R2 natijalari ko'rsatiladi.Ikkinchidan, agar siz guruhlarga bo'linsangiz, tuzatilgan o'rtacha kuchaytirish samaradorligi ko'rsatiladi.Har bir primerning kuchaytirish samaradorligi 85% dan 115% gacha ekanligiga ishonch hosil qiling.Agar u juda katta yoki juda kichik bo'lsa, bu primerning kuchaytirish samaradorligi past ekanligini anglatadi.

8-rasm Natija va ma'lumotlar chiqishi

Eksperimental jarayon:
RNK sifatiga qo'yiladigan talablar:
Tozalik:1.72.0 qoldiq izotiyosiyanat bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.Toza nuklein kislotasi A260/A230 2 atrofida bo'lishi kerak .Agar 230 nm da kuchli yutilish bo'lsa, bu fenat ionlari kabi organik birikmalar mavjudligini ko'rsatadi.Bundan tashqari, uni 1,5% agaroz jel elektroforez bilan aniqlash mumkin.Markerni ko'rsating, chunki ssRNK denaturatsiyaga ega emas va molekulyar og'irlik logarifmi chiziqli bog'liqlikka ega emas va molekulyar og'irlikni to'g'ri ifodalab bo'lmaydi.Konsentratsiya: Nazariy jihatdanemas100ng / ul dan kam, agar konsentratsiya juda past bo'lsa, tozaligi odatda past bo'ladi, baland emas

9-rasm RNK jeli

Bundan tashqari, agar namuna qimmatli bo'lsa va RNK kontsentratsiyasi yuqori bo'lsa, ekstraksiyadan keyin uni alikot qilish tavsiya etiladi va teskari transkripsiya uchun RNKni yakuniy konsentratsiyasi 100-300 ng / ulgacha suyultiriladi.Inteskari transkripsiya jarayoni, mRNK transkripsiyalanganda, teskari transkripsiya uchun polyA dumlariga maxsus bog'lana oladigan oligo (dt) primerlari, lncRNA va circRNA esa umumiy RNKning teskari transkripsiyasi uchun tasodifiy heksamer (tasodifiy 6 mer) primerlaridan foydalanadi miRNK uchun, miRNAga xos reskript neck primerlari ishlatiladi.Ko'pgina kompaniyalar hozirda maxsus qoldiq to'plamlarini ishga tushirishdi.Stem-loop usuli uchun quyish usuli qulayroq, yuqori o'tkazuvchanlik va reagentni tejash imkonini beradi, ammo bir xil oilaning miRNKlarini farqlash ta'siri ildiz-loop usuli kabi yaxshi bo'lmasligi kerak.Har bir teskari transkripsiya to'plamida genga xos primerlar (stem-looplar) kontsentratsiyasi uchun talablar mavjud.MiRNK uchun ishlatiladigan ichki ma'lumotnoma U6.Ip-loop inversiyasi jarayonida U6 ning trubkasi alohida-alohida aylantirilishi kerak va U6 ning old va orqa primerlari to'g'ridan-to'g'ri qo'shilishi kerak.Ham circRNA, ham lncRNA HKG dan ichki ma'lumot sifatida foydalanishi mumkin.IncDNKni aniqlash,
RNK bilan hech qanday muammo bo'lmasa, cDNA ham yaxshi bo'lishi kerak.Biroq, agar tajribaning mukammalligiga erishilsa, gDNK ni CD dan ajrata oladigan ichki mos yozuvlar genidan (Reference gen, RG) foydalanish yaxshidir.Umuman olganda, RG uy xo'jaligi genidir., HKG) 10-rasmda ko'rsatilganidek;O'sha paytda men soyani saqlash proteinini ishlab chiqardim va ichki ma'lumotnoma sifatida intronlarni o'z ichiga olgan aktin7 dan foydalandim.Ushbu primerning gDNKdagi kuchaytirilgan qismining o'lchami 452bp edi va agar cDNK shablon sifatida ishlatilgan bo'lsa, u 142bp edi.Keyin test natijalari cDNKning bir qismi haqiqatda gDNK bilan ifloslanganligini aniqladi va bu teskari transkripsiya natijasida hech qanday muammo yo'qligini isbotladi va uni PCR uchun shablon sifatida ishlatish mumkin.Agaroz gel elektroforezini cDNK bilan to'g'ridan-to'g'ri bajarish foydasiz va bu diffuz tarmoqli bo'lib, bu ishonarli emas.

10-rasm cDNKni aniqlash

qPCR shartlarini aniqlashto'plam protokoliga ko'ra, odatda, hech qanday muammo yo'q, asosan tm qiymatining bosqichida.Agar primerni loyihalashda ba'zi primerlar yaxshi ishlab chiqilmagan bo'lsa, natijada tm qiymati va nazariy 60 ° C o'rtasida katta farq bo'lsa, cDNA tavsiya etiladi. Namunalar aralashtirilgandan so'ng, primerlar bilan gradient PCRni o'tkazing va haroratni TM qiymati sifatida bantlarsiz belgilashdan qochishga harakat qiling.

Ma'lumotlarni tahlil qilish

An'anaviy nisbiy floresan miqdoriy PCRni qayta ishlash usuli asosan 2 ga muvofiqdir-DCT.Ma'lumotlarni qayta ishlash shablon.

Tegishli mahsulotlar:

Real Time PCR oson^TM — Taqmon

Real Time PCR oson^TM -SYBR GREEN I

RT Easy I (birinchi zanjir cDNK sintezi uchun Master Premix)

RT Easy II (qPCR uchun birinchi zanjirli cDNK sintezi uchun Master Premix)