RT-qPCR tajribasi RNK ekstraktsiyasi va sifatini baholash, teskari transkripsiya va qPCR uch bosqichni o'z ichiga oladi, har bir bosqichda juda ko'p ehtiyot choralari mavjud, biz quyida batafsil tanishtiramiz.

Ⅰ.RNK sifatini baholash

RT-qPCR tajribasida, RNK ekstraktsiyasi tugagandan so'ng, RNK sifatini baholash kerak va keyingi tajriba faqat malakali bo'lgandan keyin amalga oshirilishi mumkin.Baholash usullari spektrofotometr, Agilent gel elektroforezi, Agilent 2100 tahlilini o'z ichiga oladi, ular orasida eng ko'p ishlatiladigan spektrofotometr va agaroz jel elektroforez usulini aniqlash kiradi.Shuni ta'kidlash kerakki, RNK sifatini ta'minlash uchun RNK kontsentratsiyasini, tozaligi va yaxlitligini aniqlash va tahlil qilishni yakunlash uchun ushbu ikki usul birgalikda qo'llanilishi kerak.

Tegishli RNK izolyatsiyasi to'plami: 

Hujayra umumiy RNK izolyatsiyasi to'plami

Yuqori darajada tozalangan va yuqori sifatli umumiy RNK 11 daqiqada turli madaniyatli hujayralardan olinishi mumkin.

Hayvonlarning umumiy RNK izolyatsiyasi to'plami

Turli hayvonlar to'qimalaridan yuqori toza va sifatli umumiy RNKni tez va samarali ravishda ajratib oling.

Spektrofotometr:

Spektrofotometr asosan RNK kontsentratsiyasi va tozaligini aniqlash uchun ishlatiladi, lekin u RNK va genomik qoldiqning yaxlitligini aniqlay olmaydi.Ular orasida A260/280 va A260/230 RNK tozaligini aniqlash uchun muhim parametrlardir va RNK tozaligini ularning qiymatlarining o'zgarishiga qarab aniqlash mumkin:

1. 1,9< A260/280< 2,1, RNK tozaligi yaxshi ekanligini ko'rsatadi;A260/280<1,9, RNKda oqsil qoldig'i bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi;A260/280>2.1, bu RNKning mumkin bo'lgan qisman degradatsiyasini ko'rsatadi, bu agaroz jel elektroforezi bilan qo'shimcha tasdiqlanishi mumkin.

2. 2,0< A260/230< 2,2, RNK tozaligi yaxshi ekanligini ko'rsatadi;A260/230< 2.0, bu RNKda fenollar, etanol yoki shakar kabi organik reagentlarning qoldiqlari bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.

Agaroz gel elektroforezi:

Agaroz gel elektroforez tahlili RNK yaxlitligini, genom va oqsil qoldiqlarini tahlil qilishi mumkin, lekin RNK kontsentratsiyasini aniq aniqlay olmaydi yoki organik reagentlar qoldiqlarini aniqlay olmaydi.Masalan, eukaryotik RNK shablonlarini oling:

1. RNKga agaroz gel elektroforezi o'tkazildi.Agar gel xaritasida 28sRNK, 18sRNK va 5,8sRNK ning faqat uchta bitta bandi bo'lsa, bu ekstraksiya qilingan RNKning buzilmaganligini ko'rsatadi.Agar tortishish hodisasi bo'lsa, bu RNKning qisman degradatsiyasini ko'rsatadi.

2. Agar yelim teshigi va 28sRNK bandi o'rtasida bitta yorqin tasma bo'lsa, genomik DNK qoldig'i bo'lishi mumkin.

3. Agar elim teshigida bantlar paydo bo'lsa, bu oqsil va boshqa makromolekulyar moddalarning qoldiqlari bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.

Ⅱ. Teskari transkripsiya

RNK ekstraktsiyasi tugallangandan so'ng, uni keyingi tajribalar uchun cDNKga aylantirish kerak, shuning uchun teskari bosqich juda muhimdir.Teskari transkripsiya teskari transkriptaza va primerni tanlashdan kiritiladi:

Teskari transkriptaza tanlash:

Odatdagi teskari transkriptazalarga AMV RTase va MMLV RTase kiradi.AMV RTase ning RNase H kuchli faollik, qisqa sintez uzunligi, past sintez miqdori va yaxshi termal barqarorlikka ega (42 ~ 55 ℃).MMLV RTase ning RNase H faolligi zaif, sintez uzunligi uzoq, sintez miqdori yuqori va termal barqarorlik yomon (37 ~ 42 ℃).

RNase H fermenti RNK shablonini buzish funktsiyasiga ega bo'lganligi sababli, zaif RNase H faolligi bo'lgan MMLV teskari transkripsiya paytida afzalroq tanlanishi kerak va keyinchalik genetik muhandislikdan so'ng MMLV ning termal barqarorligi sifatli pog'onaga erishdi.Foregene olishForeasy teskari transkriptaza (teskari transkripsiya uchun M-MLV) misol sifatida, bu genetik rekombinatsiya texnologiyasidan foydalangan holda E. coli tomonidan yaratilgan bakteriyalarda ifodalangan yangi teskari transkriptaza.Bu bir zanjirli RNK, DNK yoki RNK:DNK gibrididan komplementar DNK zanjirini sintez qiluvchi rekombinant DNK polimeraza.Uning RNase H faolligi yo'q, kuchli barqarorlik, kuchli RNK yaqinligi va yuqori aniqlanish sezuvchanligi.

 

Foreasy teskari transkriptaza (teskari transkripsiya uchun M-MLV)

Astarni tanlash:

Odatda RT primerlari uchta toifaga bo'linadi: oligo dT, tasodifiy primerlar va genga xos primerlar.Turli eksperimental talablarga muvofiq foydalanish uchun mos primerlarni tanlang.

1. Agar shablon eukaryotik kelib chiqishi bo'lsa va kech cDNK muntazam PCR kuchaytirish uchun ishlatilsa, Oligo (dT) tavsiya etiladi;Agar keyingi tajriba faqat qPCR uchun ishlatilsa, teskari transkripsiya samaradorligini oshirish uchun Oligo (dT) ni tasodifiy primerlar bilan aralashtirish tavsiya etiladi.

2. Agar shablon prokaryotlardan bo'lsa, teskari transkripsiya uchun tasodifiy primerlar yoki genga xos primerlar tanlanishi kerak.

Ⅲ.qPCR

Floresan miqdorini aniqlash asosan miqdoriy usullarni tanlash, primerni loyihalash tamoyillari, ROX tanlovi, reaktsiya tizimining konfiguratsiyasi va reaktsiya sharoitlarini sozlash va boshqalardan iborat.

Miqdoriy usullarni tanlash:

Miqdoriy usullar nisbiy miqdoriy usullar va mutlaq miqdoriy usullarga bo'linadi.Nisbiy miqdoriy aniqlash muayyan davolash usullarining gen ekspressiyasiga ta'sirini aniqlash, turli vaqtlarda genlar ekspressiyasining farqini aniqlash va turli to'qimalarda genlar ifodasi farqini solishtirish uchun ishlatilishi mumkin.Mutlaq miqdorni aniqlash virusdagi nuklein kislota miqdorini aniqlashi mumkin va hokazo.Tajribalarni o'tkazishda biz o'z tajribamizga muvofiq tegishli miqdoriy usullarni tanlashimiz kerak.

Astarni loyihalash tamoyillari:

QPCR uchun primer dizayni to'g'ridan-to'g'ri kuchaytirish samaradorligi va mahsulotning o'ziga xosligi bilan bog'liq.Shuning uchun, yaxshi primerlarni to'g'ri loyihalash muvaffaqiyatli qPCRning birinchi bosqichidir.Astarni loyihalashda an'anaviy astar dizayni printsipiga rioya qilishda quyidagi printsiplarga e'tibor berish kerak:

1. Maqsadli fragmentning uzunligi 100 va 300 bp oralig'ida nazorat qilinadi;

2. Genomik DNK ta'siridan qochish uchun o'zaro ekson dizayni;

3. Loyihalashtirilgan primerlarni kuchaytirish samaradorligini tekshirish kerak va faqat kuchaytirish samaradorligi standartga (90-110%) yetganda, ularni miqdoriy tajribalar uchun ishlatish mumkin;

4. Primer konsentratsiyasi odatda 0,1uM va 1,0uM orasida optimallashtiriladi.

ni tanlashROX:

Miqdoriy reaktsiya jarayonida ROX optik yo'l farqini, pipetlash xatosini yoki bug'lanish va kondensatsiya natijasida hosil bo'lgan hajm farqini bir xilda sozlashi va natijalarning takrorlanishini yaxshilashi mumkin.Biroq, ROX ni tanlash asbob bilan bog'liqligini ta'kidlash kerak.Agar qPCR asbobi teshiklar orasidagi farqni avtomatik ravishda tuzatish funksiyasiga ega bo'lsa, unga ROX qo'shish kerak emas;aks holda, ROX tuzatish kiritish kerak.Reagentlarni sotib olishda kichik hamkorlar to'g'ri ROXni tanlash uchun ishlatiladigan asbobga muvofiq bo'lishi kerak, keyinchalik xatolarga yo'l qo'ymaslik kerak.

Reaksiya tizimini tayyorlash:

20ul va 50ul bo'lgan reaksiya hajmlariga afzallik beriladi.Tizimni shakllantirishda quyidagi masalalarga e'tibor qaratish lozim:

1. Reaktsiya tizimini o'ta toza ish stolida ventilyatsiya qilish orqali tayyorlash kerak, yangi ddH₂O har bir tajriba uchun ishlatiladi;

2. Har bir tajriba tizimda ifloslanish mavjudligini tekshirish uchun NTCni tayyorlashi kerak va tizimni tayyorlashda har bir juft primer NTCni bajarishi kerak;

3. RNK shablonida gDNK qoldig'i bor yoki yo'qligini aniqlash uchun NRT aniqlash uchun har bir namuna uchun tayyorlanishi mumkin;

4. Tizimni tayyorlashda bitta namuna uchun kamida 3 ta texnik takrorlashni bajarish tavsiya etiladi;

5. Shablon cDNA bo'lsa, qPCR tajribasida teskari transkripsiya tizimining inhibisyon ta'sirini kamaytirish uchun 5-10 marta suyultirish tavsiya etiladi.Shablon miqdorini gradient bo'yicha o'rganish yaxshiroqdir, shunda CT qiymati 20-30 gacha tushadi;

6. Kerakli reaksiyalar sonini aniqlang, reaksiyalar soniga qarab 5-10% ga oshiring va hajm konfiguratsiya raqamini hisoblang;

7, tizim premiks printsipi yordamida tayyorlanadi, santrifüjdan keyin aralashtiriladi va pufakchalar yo'qligiga ishonch hosil qiladi;

8, iloji boricha qo'llab-quvvatlovchi sarf materiallarini tanlash.

Tegishli RT-qPCR to'plami