Pipetka uchlari va EP naychalarini sterilizatsiya qilish va boshqalar.
1. Deionizatsiyalangan suv bilan 0,1% (mingdan bir) DEPC (yuqori zaharli modda) tayyorlang, uni tutun qopqog'ida ehtiyotkorlik bilan ishlating va yorug'likdan 4 ° C haroratda saqlang;
DEPC suvi DEPC bilan ishlangan va yuqori harorat va yuqori bosim bilan sterillangan toza suvdir.RNase, DNase va proteinazdan xoli ekanligi tekshirilgan.
2. Pipetka uchini va EP trubkasini 0,1% DEPC ichiga soling va pipetka uchi va EP trubkasi 0,1% DEP bilan to'ldirilganligiga ishonch hosil qiling.
3. Yorug'likdan saqlang, turing, bir kechada (12-24 soat)
4. Uchi va EP trubkasi bo'lgan qutini DEPCda namlash shart emas.DEPC suvini uchi yoki EP trubkasidagi taxminan olib tashlaganingizdan so'ng, uni o'rab oling va o'rang.
5. 121 daraja Selsiy, 30 min
6. 180 daraja Selsiy, bir necha soat quriting (kamida 3 soat)
Eslatma: a.DEPC bilan ishlaganda lateks qo'lqop va niqob kiying!b yoki DEPC sterilizatsiyasisiz, 130 ℃, 90 min avtoklav (ko'p laboratoriyalarda ikki marta yuqori haroratli sterilizatsiya)
RNK ekstraktsiyasi haqida fikrlar
To'qimalarning RNK izolyatsiyasi etishmovchiligining ikkita asosiy hodisasi
RNK degradatsiyasi va to'qimalarda aralashmalar qoldiqlari,degradatsiya haqida gapiradigan bo'lsak, keling, birinchi navbatda madaniyatli hujayralardan olingan RNK nima uchun oson parchalanmasligini ko'rib chiqaylik.Mavjud RNK ekstraktsiya reagentlarining barchasida RNazni tezda inhibe qiluvchi komponentlar mavjud.Madaniy hujayralarga lizat qo'shing va oddiygina aralashtiriladi, barcha hujayralar lizat bilan yaxshilab aralashtirilishi mumkin va hujayralar to'liq parchalanadi.Hujayralar parchalangandan so'ng, lizat tarkibidagi faol moddalar hujayra ichidagi RNazni darhol inhibe qiladi, shuning uchun RNK butunligicha qoladi.Ya'ni, ekilgan hujayralar lizat bilan oson va to'liq aloqada bo'lganligi sababli, ularning RNKsi osonlikcha parchalanmaydi;boshqa tomondan, to'qimadagi RNK osongina parchalanadi, chunki to'qimadagi hujayralar lizat bilan tezda aloqa qilish oson emas.etarli aloqa tufayli.Shunday qilib,RNK faolligini inhibe qilgan holda to'qimalarni bitta hujayraga aylantirish yo'li bor deb faraz qilsak, degradatsiya muammosini butunlay hal qilish mumkin.
Suyuq azotni maydalash eng samarali bunday usuldir.Biroq, suyuq azotni frezalash usuli, ayniqsa, namunalar soni ko'p bo'lsa, juda muammoli.Bu keyingi eng yaxshi narsani keltirib chiqardi: gomogenizator.ThegomogenizatorUsul hujayralar lizat bilan aloqa qilishdan oldin RNaz faolligi qanday inhibe qilinganligi haqidagi savolni ko'rib chiqmaydi, balki to'qimalarning buzilishi tezligi hujayra ichidagi RNazning RNni parchalash tezligidan tezroq bo'lishini ibodat qiladi.
Elektr gomogenizatorining ta'siri yaxshiroq,va shisha homogenizatorning ta'siri yomon, lekin umuman olganda, homogenizator usuli buzilish hodisasini oldini olmaydi.Shuning uchun, agar ekstraktsiya buzilgan bo'lsa, suyuq azot bilan silliqlash uchun original elektr gomogenizatoridan foydalanish kerak;original shisha gomogenizatorni elektr gomogenizatorga almashtirish yoki to'g'ridan-to'g'ri suyuq azot bilan maydalash kerak.Muammo deyarli 100% amalga oshirilishi mumkin.hal qiling.
Keyingi tajribalarga ta'sir qiluvchi nopoklik qoldiqlari muammosi buzilishdan ko'ra ko'proq sabablarga ega va echimlar mos ravishda boshqacha.Yakunida,to'qimalarda degradatsiya yoki qoldiq aralashmalar mavjud bo'lsa, maxsus eksperimental material uchun ekstraktsiya usuli/reagent optimallashtirilishi kerak.Qimmatbaho namunalaringizni optimallashtirish uchun ishlatishingiz shart emas: bozordan baliq/tovuq kabi mayda hayvonlarni sotib olishingiz mumkin, materialning tegishli qismini RNK olish uchun, ikkinchi qismini oqsil olish uchun olishingiz mumkin – og‘iz, oshqozon va ichak ekstrakti bilan maydalang.
Chiqarilgan RNKning maqsadli RNKsi turli keyingi tajribalar uchun ishlatiladi va uning sifat talablari boshqacha
cDNK kutubxonasi qurilishi ferment reaktsiyasi inhibitörlerinin qoldiqlarisiz RNK yaxlitligini talab qiladi;Shimoliy yuqori RNK yaxlitligini va ferment reaktsiyasi ingibitorlari qoldiqlari uchun past talablarni talab qiladi;RT-PCR juda yuqori RNK yaxlitligini talab qilmaydi,lekin ferment reaksiyalarini inhibe qiladi.Qoldiq talablari qat'iy.Kirish chiqishni aniqlaydi;har safar maqsad eng yuqori tozalikdagi RNKni olish bo'lsa, bu odamlarga va pulga qimmatga tushadi.
Namunalarni yig'ish/saqlash
Degradatsiyaga ta'sir qiluvchi omillar Namuna tirik tanadan/yoki asl o'sish muhitidan chiqqandan so'ng, namunadagi endogen fermentlar RNKni parchalay boshlaydi,va buzilish darajasi endogen fermentlar va harorat tarkibiga bog'liq.An'anaga ko'ra, endogen ferment faolligini to'liq inhibe qilishning faqat ikkita usuli mavjud: lizatni darhol qo'shing va yaxshilab va tez homogenlashtiring;kichik bo'laklarga kesib oling va darhol suyuq azotda muzlatib qo'ying.Har ikkala yondashuv ham tez ishlashni talab qiladi.Ikkinchisi barcha namunalar uchun mos keladi, birinchisi esa faqat hujayralar va endogen fermentlarning past tarkibiga ega bo'lgan va gomogenlash osonroq bo'lgan to'qimalar uchun mos keladi.Xususan, davom etishdan oldin o'simlik to'qimalari, jigar, timus, oshqozon osti bezi, taloq, miya, yog ', mushak to'qimalari va boshqalarni suyuq azot bilan muzlatish yaxshiroqdir.
Namunalarni parchalash va gomogenlashtirish
Degradatsiyaga va hosilga ta'sir etuvchi omillar Namuna parchalanishito'liq homogenlashtirish uchun, bu RNKning to'liq va to'liq chiqarilishi uchun.Hujayralar sindirilmasdan to'g'ridan-to'g'ri bir hil holga keltirilishi mumkin.To'qimalarni faqat singandan keyin bir hil holga keltirish mumkin.Xamirturush va bakteriyalarni bir hil holga keltirishdan oldin ularni tegishli fermentlar bilan sindirish kerak.Pastroq endogen ferment tarkibiga ega bo'lgan va osonroq gomogenizatsiyaga ega bo'lgan to'qimalarni gomogenizator yordamida bir vaqtning o'zida lizatda maydalash va gomogenlash mumkin;o'simlik to'qimalari, jigar, timus, oshqozon osti bezi, taloq, miya, yog ', mushak to'qimalari va boshqa namunalar, Ularda endogen fermentlar ko'p yoki osonlikcha homogenlashtirilmaydi,shuning uchun to'qimalarning buzilishi va homogenizatsiyasi alohida bajarilishi kerak.Parchalanishning eng ishonchli va samarali usuli suyuq azot bilan maydalash, gomogenlashning eng ishonchli usuli esa elektr gomogenizatordan foydalanish hisoblanadi.Suyuq azot bilan maydalash haqida alohida eslatma: namunani butun frezalash jarayonida eritib yubormaslik kerak, chunki muzlatilgan holda endogen fermentlar ko'proq ishlaydi.
Lizat tanlash
Operatsion qulayligi va qoldiq endogen aralashmalar omillariga ta'sir qilish Ko'p ishlatiladigan liziz eritmalari RNase faolligini deyarli inhibe qilishi mumkin.Shuning uchun lizis eritmasini tanlashning asosiy nuqtasi tozalash usuli bilan birgalikda ko'rib chiqishdir.Bitta istisno mavjud:yuqori endogen ferment tarkibiga ega bo'lgan namunalar endogen fermentlarni inaktivatsiya qilish qobiliyatini oshirish uchun fenol o'z ichiga olgan lizatdan foydalanish tavsiya etiladi.
Tozalash usulini tanlash
Qoldiq endogen aralashmalarga ta'sir qiluvchi omillar, ekstraktsiya tezligi Hujayralar kabi toza namunalar uchun deyarli har qanday tozalash usuli bilan qoniqarli natijalarga erishish mumkin.Ammo boshqa ko'plab namunalar uchun, ayniqsa o'simliklar, jigar, bakteriyalar va boshqalar kabi yuqori darajadagi aralashmalarga ega bo'lganlar uchun mos tozalash usulini tanlash juda muhimdir.Ustunni santrifüj tozalash usuli tez ekstraksiya tezligiga ega va RNKning keyingi fermentativ reaktsiyasiga ta'sir qiluvchi aralashmalarni samarali ravishda olib tashlashi mumkin, ammo bu qimmat (Foregene tejamkor to'plamlarni taklif qilishi mumkin, batafsil ma'lumotni bosing.Bu yerga);LiCl yog'inlari kabi iqtisodiy va klassik tozalash usullarini qo'llash ham qoniqarli natijalarga erishishi mumkin, ammo operatsiya muddati uzoq..
RNK ekstraktsiyasi uchun "Uch intizom va sakkizta e'tibor"
Intizom 1:Ekzogen fermentlarning ifloslanishiga chek qo'ying.
Eslatma 1:Niqob va qo'lqop kiyishga qat'iy rioya qiling.
Eslatma 2:Tajribaga jalb qilingan santrifüj naychalari, uchi boshlari, pipetka tayoqchalari, elektroforez tanklari va tajriba skameykalari yaxshilab utilizatsiya qilinishi kerak.
Eslatma 3:Tajribaga jalb qilingan reagentlar/eritmalar, ayniqsa suv, RNazsiz bo'lishi kerak.
2-intizom:Endogen fermentlarning faolligini blokirovka qilish
Eslatma 4:Tegishli gomogenizatsiya usulini tanlang.
Eslatma 5:Tegishli lizatni tanlang.
Eslatma 6:Namuna boshlang'ich miqdorini nazorat qiling.
3-intizom:Chiqarish maqsadingizni aniqlang
Eslatma 7:Har qanday lizat tizimi namunaning maksimal boshlang'ich miqdoriga yaqinlashganda, ekstraksiya muvaffaqiyati darajasi keskin pasayadi.
Eslatma 8:Muvaffaqiyatli RNK ekstraktsiyasining yagona iqtisodiy mezoni - bu hosil emas, balki keyingi tajribalardagi muvaffaqiyat.
RNaz bilan ifloslanishning eng yaxshi 10 manbalari
1. Barmoqlar ekzogen fermentlarning birinchi manbaidir, shuning uchun qo'lqop kiyish va tez-tez almashtirilishi kerak.Bundan tashqari, niqoblar ham kiyish kerak, chunki nafas olish ham fermentlarning muhim manbai hisoblanadi.Qo'lqop niqobini kiyishning qo'shimcha foydasi eksperimentatorni himoya qilishdir.
2. Pipetka uchlari, santrifüj naychalari, pipetkalar – RNazni faqat sterilizatsiya yo‘li bilan faolsizlantirib bo‘lmaydi, shuning uchun pipetka uchlari va santrifuga naychalari DEPC bilan ishlov berilgan deb belgilangan bo‘lsa ham, DEPC bilan ishlov berilishi kerak.Maxsus maqsadli pipetkadan foydalanish yaxshidir, uni ishlatishdan oldin 75% spirtli paxta bilan artib oling, ayniqsa novda;qo'shimcha ravishda, boshni tozalash vositasidan foydalanmaslikka ishonch hosil qiling.
3. Suv/bufer RNase bilan ifloslanmagan bo'lishi kerak.
4. Hech bo'lmaganda sinov stolini 75% spirtli paxta bilan artib tashlash kerak.
5.Endogen RNase Barcha to'qimalarda endogen fermentlar mavjud, shuning uchun to'qimalarni suyuq azot bilan tez muzlatish degradatsiyani kamaytirishning eng yaxshi usuli hisoblanadi.Suyuq azotni saqlash / maydalash usuli haqiqatan ham noqulay, ammo bu endogen fermentlarning yuqori darajasi bo'lgan to'qimalar uchun yagona usul.
6. RNK namunalari RNK ekstraktsiyasi mahsulotlarida RNase kontaminatsiyasining izlari bo'lishi mumkin.
7. Plazmid ekstraktsiyasi Plazmid ekstraktsiyasi ko'pincha RNKni parchalash uchun Rnazadan foydalanadi va qoldiq Rnase Proteinase K bilan hazm qilinishi va PCI orqali ekstraktsiya qilinishi kerak.
8. RNKni saqlash Agar u past haroratda saqlansa ham, RNazning iz miqdori RNK degradatsiyasiga olib keladi.RNKning uzoq muddatli saqlanishi uchun eng yaxshi yechim tuz/spirtli suspenziya hisoblanadi, chunki alkogol past haroratlarda barcha fermentativ faollikni inhibe qiladi.
9. Kationlar (Ca, Mg) bu ionlarni o'z ichiga olgan bo'lsa, 80C da 5 daqiqa davomida qizdirish RNKning parchalanishiga olib keladi, shuning uchun RNKni qizdirish kerak bo'lsa, saqlovchi eritmada xelatlashtiruvchi vosita (1mM natriy sitrat, pH 6,4) bo'lishi kerak.
10. Keyingi tajribalarda ishlatiladigan fermentlar RNase bilan ifloslangan bo'lishi mumkin.
RNK olish uchun 10 ta maslahat
1: RNase faolligini tezda oldini olish.Namunalar yig'ilgandan so'ng tezda muzlatiladi va liziz paytida RNase tezkor operatsiya natijasida inaktivlanadi.
2: Yuqori ribozim tarkibiga ega bo'lgan to'qimalar uchun mos ekstraksiya usulini tanlang va yog 'to'qimalari fenol o'z ichiga olgan usuldan foydalanish eng yaxshisidir.
3: bashorat sifati Shimoliy talab qiladi, cDNA kutubxonasi qurilishi yuqori yaxlitlikni talab qiladi va RT-PCR va RPA (Ribonukleazni himoya qilish tahlili) yuqori yaxlitlikni talab qilmaydi.RT-PCR yuqori tozalikni talab qiladi (ferment inhibitori qoldiqlari).
4: To'liq homogenizatsiya hosildorlikni oshirish va degradatsiyani kamaytirishning kalitidir.
5: RNK elektroforezini aniqlashning yaxlitligini tekshiring, 28S: 18S = 2: 1 - to'liq belgi, 1: 1 ko'pchilik tajribalar uchun ham qabul qilinadi.
6: RT-PCR uchun DNKni olib tashlash, massiv tahlili DNKni olib tashlash uchun Dnase I dan foydalanish yaxshidir.
7: Ekzogen fermentlarning ifloslanishini kamaytiring - fermentlarni tashqaridan import qilish mumkin emas.
8: Past konsentratsiyali nuklein kislotani konsentratsiyalashda birgalikda cho'kma reagentini qo'shish kerak.Lekin fermentlar va DNK ifloslanishini o'z ichiga co-presipitant oldini olish uchun.
9: RNKni yaxshilab eritib oling, agar kerak bo'lsa, 65C da 5 daqiqa davomida qizdiring.
mos saqlash usuli
-20C da qisqa vaqt, -80C da uzoq vaqt saqlanishi mumkin.RNK hosildorligini oshirishning birinchi bosqichi turli xil namunalardagi RNK tarkibi juda katta farq qilishini tushunishdir.Jigar, oshqozon osti bezi, yurak kabi yuqori ko'p (2-4ug / mg), miya, embrion, buyrak, o'pka, timus, tuxumdon kabi o'rtacha (0,05-2ug / mg), siydik pufagi, suyak, yog 'kabi kam miqdorda (<0,05ug / mg) mg).
1: RNni chiqarish uchun hujayralarni lizing - agar RNK chiqarilmasa, hosil kamayadi.Elektr gomogenizatsiyasi boshqa gomogenizatsiya usullariga qaraganda yaxshiroq ishlaydi, lekin suyuq azotni maydalash, fermentativ hazm qilish (Lizozim / Litikaza) kabi boshqa usullar bilan birlashtirilishi kerak bo'lishi mumkin.
2: Ekstraksiya usulini optimallashtirish.Fenolga asoslangan usullarning eng katta muammolari to'liq bo'lmagan tabaqalanish va qisman RNK yo'qolishidir (supernatantni butunlay olib tashlash mumkin emas).To'liq bo'lmagan tabaqalanish nuklein kislotasi va oqsil miqdori yuqori bo'lib, uni ishlatiladigan lizat miqdorini oshirish yoki namuna miqdorini kamaytirish orqali hal qilish mumkin.Yog 'to'qimalariga xloroformni ekstraktsiya qilish bosqichi qo'shildi.RNKning yo'qolishini orqaga pompalash yoki organik qatlamni olib tashlash va keyin sentrifugalash yo'li bilan kamaytirish mumkin.Ustunli santrifüjga asoslangan usullarning eng katta muammosi ortiqcha namunadir.
Klassik ekstraktsiya bo'yicha maslahatlar
1. Fenolni tozalash: 1:1 Fenol/Xloroform miqdoriga teng miqdorda qo'shing va 1-2 daqiqa davomida kuchli aralashtiriladi.2 daqiqa davomida yuqori tezlikda santrifüj qiling.Supernatantni (80-90%) ehtiyotkorlik bilan olib tashlang.Hech qachon o'rta qatlamga tushmang.Fenol/xloroformga teng hajmdagi reaksiya eritmasi qo'shilishi va supernatantni olib tashlash mumkin.Hosildorlikni oshirish uchun ikkita supernatantni nuklein kislotasi bilan cho'ktirish uchun aralashtirish mumkin.Aralashtirganda juda yumshoq bo'lmang va barcha supernatantni olib tashlashga urinmang.
2. 70-80% etanol bilan yuvish: yuvish vaqtida qoldiq tuzning yuvilishini ta'minlash uchun nuklein kislotani to'xtatib turish kerak.Shu bilan birga, etanolni to'kib tashlaganingizdan so'ng, bir necha soniya davomida yuqori tezlikda santrifüj qiling, so'ngra qoldiq etanolni pipetka bilan olib tashlang.Xona haroratida 5-10 daqiqa turgandan keyin eritiladi.
11. Maxsus tashkilotlarni chiqarish
1. Fibröz to'qima: yurak / skelet mushaklari kabi tolali to'qimalardan RNK ekstraktsiyasining kaliti to'qimalarni to'liq buzishdir.Bu to'qimalarda hujayra zichligi past bo'ladi, shuning uchun to'qimalarning og'irligi birligiga to'g'ri keladigan RNK miqdori past bo'ladi va iloji boricha ko'proq boshlang'ich miqdordan foydalanish yaxshidir.Muzlatish sharoitida to'qimalarni yaxshilab maydalashni unutmang.
2. Protein/yog 'miqdori yuqori bo'lgan to'qimalar: miya / o'simlik yog'i miqdori yuqori.PCI ekstraktsiyasidan so'ng, supernatantda oq flokulalar mavjud.Supernatantni xloroform bilan qayta ekstraksiya qilish kerak.
3. Nuklein kislota/ribozim miqdori yuqori bo'lgan to'qimalar: taloq/timusda nuklein kislota va ribozim miqdori yuqori.To'qimalarni muzlash sharoitida silliqlash, so'ngra tez gomogenizatsiya ribozimlarni samarali ravishda inaktivlashtirishi mumkin.Biroq, agar lizat juda yopishqoq bo'lsa (yuqori nuklein kislotasi tufayli), PCI ekstraktsiyasi samarali tabaqalana olmaydi;ko'proq lizat qo'shish bu muammoni hal qilishi mumkin.Bir nechta PCI ekstraktsiyalari ko'proq qoldiq DNKni olib tashlashi mumkin.Agar spirtli ichimliklarni qo'shgandan so'ng darhol oq cho'kma hosil bo'lsa, bu DNKning ifloslanishini ko'rsatadi.Eritishdan keyin kislotali PCI bilan qayta ekstraksiya qilish DNK ifloslanishini olib tashlashi mumkin.
4. O'simlik to'qimasi: O'simlik to'qimasi hayvonlar to'qimalariga qaraganda ancha murakkab.Odatda, o'simliklar suyuq azot sharoitida maydalanadi, shuning uchun endogen fermentlar tomonidan RNK parchalanishi kam uchraydi.Degradatsiya muammosi hal etilmasa, bu deyarli, albatta, namunadagi aralashmalar tufayli yuzaga keladi.Ko'pgina o'simliklar tarkibidagi aralashmalar qoldiqlarga olib keladi va qoldiqlarning sababi ko'pincha bu aralashmalar RNK bilan o'xshashliklarga ega: siz cho'ktirasiz va men cho'ktiraman va siz adsorbsiya qilaman va men adsorbsiyaman.Bu xususiyatlar ularning juda kuchli ferment inhibitörleri ekanligini aniqlaydi.
Hozirgi vaqtda tijorat RNK ekstraktsiyasi reagentlari deyarli barcha hayvonlar to'qimalariga kichik o'zgarishlar bilan moslashtirilishi mumkin, ammo ko'pchilik o'simlik to'qimalariga mos bo'lishi mumkin bo'lgan bir nechta tijorat RNK ekstraktsiyasi reagentlari mavjud.Yaxshiyamki, Foregene maxsus taqdim etishi mumkino'simlik RNK ekstraktsiya to'plamlari, bizda ... borO'simliklarning umumiy RNK izolyatsiyasi to'plami, O'simlik umumiy RNK izolyatsiyasi to'plami Plus.Ikkinchisi polisakkarid va polifenol miqdori yuqori bo'lgan o'simliklar uchun maxsus mo'ljallangan.RNK ekstraktsiyasi uchun laboratoriya foydalanuvchilarining fikr-mulohazalari ayniqsa yaxshi.
12. Namunani muzlatish va eritishning ta'siri Muzlatilgan namuna kattaroq bo'lishi mumkin va uni RNK ekstraktsiyasi uchun ishlatishdan oldin kesish kerak.Namunalar kesish paytida eriy boshlaydi (ehtimol qisman).Muzlatilgan namunalarni RNK ekstraktsiyasidan oldin tortish kerak bo'lishi mumkin va bu jarayon davomida eritish albatta sodir bo'ladi.Ba'zida namunaning erishi suyuq azotni maydalash jarayonida ham sodir bo'ladi;yoki muzlatilgan namuna suyuq azot frezalamasdan to'g'ridan-to'g'ri lizatga qo'shiladi va eritish, albatta, to'liq homogenlashdan oldin sodir bo'ladi.Tajribalar shuni ko'rsatdiki, muzlatilgan to'qimalar eritish paytida RNK degradatsiyasiga yangi to'qimalarga qaraganda ko'proq moyil bo'ladi.Mumkin sabab: Muzlatish-eritish jarayoni hujayra ichidagi tuzilmalarni buzadi, bu endogen fermentlarning RNK bilan bevosita aloqa qilishini osonlashtiradi.
13. RNK sifatini baholash Odatda, elektroforez RNKning yaxlitligini baholash uchun, A260/A280 esa RNKning tozaligini baholash uchun ishlatiladi.Nazariy jihatdan, buzilmagan RNK 28S: 18S = 2,7: 1 nisbatiga ega va ko'pchilik ma'lumotlar 28S: 18S = 2: 1 nisbatiga urg'u beradi.Gap shundaki, hujayralardan tashqari namunalardan olingan RNKning deyarli hech biri 2:1 nisbatda emas (bu Agilent Bioanalyzer yordamida olingan).
RNKning elektroforez natijalariga ko'plab omillar ta'sir qiladi, jumladan, ikkilamchi tuzilish, elektroforez sharoitlari, namuna yuki, EB tomonidan to'yinganlik darajasi va boshqalar. RNKni aniqlash uchun mahalliy elektroforezdan foydalaning va nazorat sifatida DNK Markerdan foydalaning.Agar 2kb da 28S va 0,9kb da 18S aniq bo'lsa va 28S: 18S > 1 bo'lsa, yaxlitlik keyingi tajribalarning ko'pchiligi talablariga javob berishi mumkin.
A260/A280 - bu juda ko'p chalkashliklarga sabab bo'lgan ko'rsatkich.Avvalo, nuklein kislotalar uchun ushbu ko'rsatkichning asl ma'nosini aniqlab olish kerak: sof RNK, uning A260/280 = taxminan 2,0.Sof RNK "sabab" va A260/A280 = 2 "ta'sir" dir.Endi hamma A260/A280 dan “sabab” sifatida foydalanmoqda va “agar A260/A280 = 2 bo‘lsa, demak, RNK toza” deb o‘ylaydi, bu tabiiy ravishda chalkashlikka olib keladi.
Agar siz qiziqsangiz, siz RNK namunangizga fenol, guanidin izotiosiyanat, PEG va boshqalar kabi ekstraktsiyada tez-tez ishlatiladigan ozgina reagent qo'shishingiz va keyin A260/A280 nisbatini o'lchashingiz mumkin.Haqiqat shundaki, RNK ekstraktsiyasi uchun ishlatiladigan ko'plab reagentlar, shuningdek namunadagi ko'plab aralashmalar A260 va A280 atrofida so'riladi va A260/A280 ga ta'sir qiladi.
Hozirgi vaqtda eng ibratli yondashuv 200-300 nm diapazonda RNK namunalarini skanerlashdir.Sof RNK egri chizig'i quyidagi xususiyatlarga ega: egri chiziq silliq, A230 va A260 ikkita burilish nuqtasi, A300 0 ga yaqin, A260/A280 = 2,0 atrofida va A260/A230 = 2,0 atrofida.Agar skanerlash ma'lumotlari mavjud bo'lmasa, A260/A230 nisbati ham aniqlanishi kerak, chunki bu nisbat fermentativ reaktsiyaga ta'sir qiluvchi barcha aralashmalarning o'tkazilishiga nisbatan sezgirroqdir.Qurilmaning chiziqli diapazonini hisobga oling (A260 uchun 0,1–0,5).
Yana ikkita foydali hodisa mavjud: A260/A280 suvda o'lchanganda nisbat taxminan 0,3 ga past bo'ladi;10 mM EDTAda o'lchangan nisbat 1 mM EDTAda o'lchanganidan taxminan 0,2 ga yuqori.
Tegishli mahsulotlar:
RNK izolyatsiyasi seriyasi - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Yuborilgan vaqt: 2022-yil-15-iyul
