Biz tajribali ishlab chiqaruvchi bo'ldik.Katta chegirmali Xitoy yuqori sezuvchanlik bir bosqichli prob Rt- uchun o'z bozorining muhim sertifikatlarida ko'pchilikni qo'lga kiritdi.QpcrKit V2, Sifat - zavod hayoti, Mijozlarning talabiga e'tibor - kompaniyaning omon qolishi va rivojlanishining manbai, Biz halollik va vijdonli mehnat munosabatlariga rioya qilamiz, sizning kelishingizni intiqlik bilan kutamiz!
Biz tajribali ishlab chiqaruvchi bo'ldik.O'z bozorining muhim sertifikatlarida ko'pchilikni yutib olishXitoy Taq DNK polimeraza, Qpcr, Bizning kompaniyamiz va'da qiladi: o'rtacha narxlar, qisqa ishlab chiqarish vaqti va qoniqarli sotishdan keyingi xizmat, biz sizni xohlagan vaqtda fabrikamıza tashrif buyurishingizni xush ko'ramiz.Endi biz birgalikda yoqimli va uzoq muddatli biznesimiz bo'lishini tilayman!!!

Tavsiflar

Ushbu to'plam RT-qPCR reaktsiyalari uchun madaniyatli hujayra namunalaridan RNKni tezda chiqarib yuborishi mumkin bo'lgan noyob lizis bufer tizimidan foydalanadi va shu bilan ko'p vaqt talab qiluvchi va mashaqqatli RNKni tozalash jarayonini yo'q qiladi.RNK shablonini atigi 7 daqiqada olish mumkin.To'plam tomonidan taqdim etilgan 5×Direct RT Mix va 2×Direct qPCR Mix-SYBR reagentlari real vaqtda PCR natijalarini tez va samarali olishi mumkin.

5×Direct RT Mix va 2×Direct qPCR Mix-SYBR kuchli inhibitor bardoshliligiga ega va namunalar lizatidan bevosita RT-qPCR uchun shablon sifatida foydalanish mumkin.Ushbu to'plam noyob RNK yuqori afinitetli Foregene teskari transkriptaza va Hot D-Taq DNK polimeraza, dNTPs, MgCl ni o'z ichiga oladi.₂, reaksiya buferi, PCR optimallashtiruvchisi va stabilizatori.

Texnik xususiyatlari

200×20ml Rxns, 1000×20ml Rxns

To'plam komponentlari

Xususiyatlari va afzalliklari

■ Oddiy va samarali: Cell Direct RT texnologiyasi yordamida RNK namunalarini atigi 7 daqiqada olish mumkin.

■ Namuna talabi kichik, 10 ta hujayrani sinab ko'rish mumkin.

■ Yuqori o'tkazuvchanlik: u 384, 96, 24, 12, 6 quduqli plastinkalarda o'stirilgan hujayralardagi RNKni tezda aniqlay oladi.

■ DNK Eraser bo'shatilgan genomlarni tezda olib tashlashi, keyingi eksperimental natijalarga ta'sirini sezilarli darajada kamaytirishi mumkin.

■ Optimallashtirilgan RT va qPCR tizimi ikki bosqichli RT-PCR teskari transkripsiyasini samaraliroq va PCRni yanada aniqroq va RT-qPCR reaktsiyasi inhibitörlerine nisbatan chidamliroq qiladi.

Kit ilovasi

Qo'llash doirasi: madaniy hujayralar.

- Namuna lizisi orqali chiqarilgan RNK: faqat ushbu to'plamning RT-qPCR shabloniga tegishli.

- To'plamdan quyidagi maqsadlarda foydalanish mumkin: gen ekspressiyasini tahlil qilish, siRNK vositachiligidagi genlarni o'chirish effektini tekshirish, dori skriningi va boshqalar.

Diagramma

Saqlash va saqlash muddati

Ushbu to'plamning I qismi 4℃ haroratda saqlanishi kerak;II qism -20 ℃ da saqlanishi kerak.

Foregene Protease Plus II 4 ℃ haroratda saqlanishi kerak, -20 ℃ da muzlatib qo'ymang.

Reagent 2×Direct qPCR Mix-SYBR qorong'uda -20 ℃ haroratda saqlanishi kerak;Agar tez-tez ishlatilsa, u qisqa muddatli saqlash uchun 4 ℃ da saqlanishi mumkin (10 kun ichida foydalaning). Biz tajribali ishlab chiqaruvchimiz.Katta chegirmali Xitoyning yuqori sezuvchanlik bir bosqichli prob Rt-Qpcr to'plami V2 bo'yicha o'z bozorining muhim sertifikatlarida ko'pchilikni qo'lga kiritamiz, Sifat - zavod hayoti, Mijoz talabiga e'tibor - kompaniyaning omon qolishi va rivojlanishining manbai, Biz halollik va vijdonli mehnat munosabatlariga rioya qilamiz, sizning kelishingizni intiqlik bilan kutamiz!
Katta chegirmaXitoy Taq DNK polimeraza, Qpcr, Bizning kompaniyamiz va'da qiladi: o'rtacha narxlar, qisqa ishlab chiqarish vaqti va qoniqarli sotishdan keyingi xizmat, biz sizni xohlagan vaqtda fabrikamıza tashrif buyurishingizni xush ko'ramiz.Endi biz birgalikda yoqimli va uzoq muddatli biznesimiz bo'lishini tilayman!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Cat.No.DRT-01021/01022

≤ 1000 000 hujayradan foydalangan holda to'g'ridan-to'g'ri hujayra RT-qPCR uchun

Mahsulot taqdimoti

Ushbu mahsulot RT-qPCR reaktsiyalari uchun kulturali hujayra namunalaridan RNKni tezda chiqarish uchun noyob lizis bufer tizimidan foydalanadi, bu ko'p vaqt talab qiluvchi va mashaqqatli RNKni tozalash jarayonini bartaraf qiladi va kerakli RNK shablonini olish uchun bor-yo'g'i 7 daqiqa vaqt sarflaydi.

5 × Direct RT Mix va 2 × Direct qPCR Mix-Taqman kuchli inhibitor bardoshliligiga ega va shablon sifatida o'lchanadigan namunaning lizatidan foydalangan holda samarali teskari va maxsus kuchaytirishni amalga oshirishi mumkin.Reagent tarkibida Foregene teskari transkriptaza, issiq D-Taq DNK polimeraza, dNTP, MgCl mavjud.₂, Reaktsiya buferi, PCR optimallashtiruvchisi va stabilizatori, bu namunalarni tez va oson aniqlash uchun lizis buferi bilan ishlatilishi mumkin va yuqori sezuvchanlik, o'ziga xoslik va barqarorlik xususiyatlariga ega.

Mahsulot xususiyatlari

Oddiy, samarali Cell Direct RT texnologiyasi, RNK namunalarini olish uchun 7 daqiqadan kamroq vaqt ketadi.

Namuna talablari kichik va eksperiment uchun kamida 10 madaniyatli hujayradan foydalanish mumkin.

384, 96, 24, 12 va 6-quduqli plitalar kabi madaniyatli hujayralarni RNKni tez olish uchun yuqori o'tkazuvchanlik.

DNK Eraser chiqarilgan genomlarni tezda olib tashlashga qodir, bu esa keyingi eksperimental natijalarga ta'sirni sezilarli darajada kamaytiradi.

Optimallashtirilgan RT va qPCR tizimlari ikki bosqichli RT-PCRni yanada samarali teskari transkripsiya, o'ziga xoslik va kuchliroq RT-qPCR reaktsiya inhibitori bardoshliligi bilan ta'minlaydi.

Kit ilovasi

Qo'llash doirasi: Madaniy hujayralar.

Namuna lizisi talqin qilingan RNK: faqat ikki bosqichli RT-qPCR shablon sifatida ishlatiladi.

To'plamlar quyidagi maqsadlarda ishlatilishi mumkin: genlarni tartibga solish ifodasini tahlil qilish, allel testi, dori skriningi va boshqalar.

Kit cheklovlari

Kuchaytirilgan fragmentlar ≤ 300 bp.

To'plamlar hujayralarni yangi etishtirish uchun ishlatiladi.

Mahsulot sifatini nazorat qilish

FOREGENE kompaniyasining umumiy sifat menejmenti tizimiga ko'ra, Cell Direct RT-qPCR seriyali to'plamlarining har bir partiyasi har bir to'plam sifatining ishonchliligi va barqarorligini ta'minlash uchun bir necha marta qattiq sinovdan o'tkaziladi.

To'plam tarkibi

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqmanni alohida sotib olish mumkin, tafsilotlar 1-ilovada keltirilgan (13-SAHIF).

Saqlash shartlari

1. Yetkazib berish shartlari

To'plamning <4 °C holatida bo'lishini ta'minlash uchun past haroratli muz to'plami qutisini tashishning butun jarayoni.

2. Saqlash shartlari

I qismni 4°C da, II qismini -20°C da saqlang.

Foregene Protease Plus II ni 4°C haroratda saqlash kerak, -20°C da muzlatilmaydi.

Reagent 2× Direct qPCR Mix-Taqman -20°C da yoki tez-tez ishlatilsa (10 kun ichida) qisqa muddatli foydalanish uchun 4°C da saqlanadi.

To'plam komponentlari haqida ma'lumot

Bufer CL: Hujayra lizis reaktsiyalari uchun zarur bo'lgan muhitni ta'minlaydi.

Bufer ST: keyingi RTga ta'sir qilmaslik uchun lizatdagi faol moddani tugatadi.

DNK Eraser: DNKni olib tashlash vositasi, genomni olib tashlashning keyingi tajribalarga ta'siri.

5 × Direct RT Mix: Yuqori RNK yaqinligi Foregene teskari transkriptaza, RNaz inhibitori, dNTPlar, stabilizatorlar, kuchaytirgichlar, optimallashtiruvchilar va optimal moslashtirish uchun teskari transkripsiya primerlarini o'z ichiga oladi (Random Primer, Oligo(dT))₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: Lizis buferi kontekstida hujayralar nuklein kislotalarni chiqarish uchun parchalanadi.

2 × Direct qPCR Mix-Taqman: Bu reaktivda issiq D-Taq DNK polimeraza, dNTPs, MgCl mavjud.₂, reaksiya buferi, PCR optimallashtiruvchisi va stabilizator.

20 × ROX Reference Dye: Odatda ABI, Stratagene va boshqa kompaniyalarning Real Time PCR kuchaytirish asboblarida qo'llaniladi, u PCR dozalash xatolaridan kelib chiqqan PCR naychalari va naychalari o'rtasidagi farqni sozlash uchun ishlatiladi.Turli asboblar uchun talab qilinadigan 20× ROX Reference Dye konsentratsiyasi har xil va foydalanuvchi uni asbobning tavsiya etilgan kontsentratsiyasiga muvofiq qo‘shishi mumkin.

RNazsiz ddH₂O: Ikki bosqichli RT-qPCR reaktsiyalari uchun RNazsiz sterillangan ultra toza suv.

Ehtiyot choralari:(To'plamni ishlatishdan oldin ehtiyot choralarini diqqat bilan o'qib chiqing)

Namunalar orasidagi o'zaro kontaminatsiyani oldini olish uchun eksperimentning ishlash usuliga e'tibor bering.

RNase ifloslanishini va RNK degradatsiyasini oldini olish uchun eksperimental muhit va idishlarning tozaligiga e'tibor bering.

Yangi yoki yaxshi saqlangan hujayra namunalarini oling va hech qachon takroriy muzlatilgan eritilgan hujayra namunalarini ishlatmang.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman takroriy muzlatish-eritishdan qochishi kerak, aks holda bu teskari transkripsiya va PCR samaradorligiga ta'sir qiladi.

Tayyorlashratsionoldinoperatsiya

Ushbu to'plamni ishlatishdan oldin ko'rsatmalarni diqqat bilan o'qib chiqing.Cell Direct RT-qPCR to'plami oddiy, qulay va tez ishlaydi va ko'rsatmalar butun to'plam va undan qanday to'g'ri foydalanish haqida to'liq ma'lumot beradi.Ishlatishdan oldin kerakli eksperimental materiallar va jihozlarni tayyorlang.

Eksperimental materiallar va jihozlar

◆ Madaniyat hujayralari.

◆ 1,5 ml yoki 2 ml, RNase-/DNase-Free sentrifuga naychasi, RNase-/DNase-Free uchi, 0,2 ml steril qPCR trubkasi.

◆ qPCR mashinasi, pipetka, stol usti santrifugasi (≥13 400×g) (eksperimental ehtiyojlarga qarab) va boshqalar.

Xavfsizlik

◆ Ushbu mahsulot faqat ilmiy tadqiqot uchun moʻljallangan, iltimos, uni farmatsevtika, klinik, oziq-ovqat va kosmetika maqsadlarida ishlatmang.

◆ Kimyoviy moddalardan foydalanganda tegishli laboratoriya kiyimi, qoʻlqop, himoya koʻzoynagi va hokazo taqing.

Operatsiyaqo'llanmalar

Hujayra lizisi tizimlari, RT tizimlari va qPCR reaktsiya eritmasi qo'shimcha paketlarini 1-ilovada batafsil ma'lumot olish uchun alohida sotib olish mumkin (13-SAHIF).

Operatsion qo'llanma

Javob: RNK chiqarish namunasi

1. Hujayralar oldindan ishlov berildi: Hujayra madaniyati plastinkasini sovuq PBS bilan yuving, so'ngra hujayralarni lizing (10-10)⁶), 10⁶ hujayralar miqdoridan ko'ra, RNKni ajratib olish va tozalash uchun Hujayrani RNK izolyatsiyasi to'plamini (DE-03111) yoki Hayvonlarning umumiy RNK izolyatsiyasi to'plamini (DE-03011) Foregene tavsiya etiladi.

1.1.Yopishqoq hujayralar (misol sifatida 24 quduqli plastinka)

1.1.1.Har bir quduqdagi hujayralar sonini aniqlang, hujayralar soni 1 × 10 ekanligini aniqlang⁵, va madaniy muhitni madaniyat idishidan olib tashlash uchun pipetkadan foydalaning.

1.1.2.Har bir quduqqa 200 mkl oldindan sovutilgan 1 × PBS qo'shing.Qayta-qayta pipet qilmang va PBSni quduqlardan olib tashlang.Plastinani egib, iloji boricha ko'proq PBS olib tashlang.2-bosqichga o'ting.

1.1.3.Turli hujayra madaniyati idishi yoki hujayra madaniyati idishidagi 1-1 mos yozuvlar raqami jadvaliga hujayra yuvish uchun oldindan sovutilgan 1 × PBS qo'shildi.

Jadval 1-1: Turli xil hujayralar soni uchun PBS dozasi

Eslatma:Qattiq yopishgan hujayralarni ta'minlash uchun,yuvish paytida ko'p sonli hujayra yo'qolishi oldini oladi.

1.2.Suspenziya xujayralari yoki g'ovak bo'lmagan plastinkalarda o'stirilgan yopishtiruvchi hujayralar

1.2.1.Ko'p quduqli bo'lmagan plastinkalarda o'stirilgan yopishtiruvchi hujayralar (suspenziya xujayralari keyingi bosqich 1.2.2 dan boshlanadi), hujayralarni oddiy hujayralarni yig'ish usuli bo'yicha yig'adi va ajratadi va ularni madaniyat plastinkasiga yoki sentrifuga trubasiga joylashtiring;agar tripsinizatsiya ishlatilsa, hujayralarni to'plash va qoldiq tripsinni olib tashlash uchun santrifüj qilishni talab qiling, hujayralarni tarqatish uchun PBS qayta suspenziyalangan hujayralarni alohida hujayralarga qo'shdi.

1.2.2.Hujayralar soni hisoblangandan so'ng, hujayralar 1 × 10 bo'linadi⁵ bir santrifüj naychalari uchun, 10 daqiqa davomida 1000 × g da sentrifugalash orqali hujayralarni yig'ish.

1.2.3.Santrifuga trubasiga 200 mkl PBS qo'shing, qayta-qayta pipet qilmang va PBSni to'g'ridan-to'g'ri aspiratsiya qiling.2-bosqichga o'ting. (Agar cho'ktirish qiyin bo'lsa va hujayralar qayta suspenziyalangan bo'lsa, supernatant tashlangandan keyin 10 minutdan keyin 1000 × g santrifüj qilish mumkin, hujayra pelleti 2-bosqichga o'ting)

2.Hujayra lizisi: Bufer CL ni, uning harorati xona haroratiga tenglashtirilgan DNK Eraser va Foregene Protease Plus II ni quyidagi jadval 1-2 tayyorlangan liziz tizimiga muvofiq olib tashlang: (Lizis eritmasi foydalanishga tayyor).

1-2-jadval: bo'linish tizimni tayyorlash (Izoh: muz ustida tayyorlashda)

3.(misol sifatida 24-quduqli plastinka) Har bir quduqqa 200 mkl hujayra lizisi master aralashmasini pipetka bilan soling, 5-10 marta qayta-qayta puflang, xona haroratida (20-25 ℃) 5 daqiqa davomida inkubatsiya qiling.

Eslatma:Pufakchalar paydo bo'lishiga yo'l qo'ymaslik uchun pipetka shkalasini 200 mkl yoki undan kamroq qilib o'rnatganingizda iltimos.Lizisdan keyin hujayralar loyqa ko'rinishi mumkin, bu normaldir.

4. (misol sifatida 24-quduqli plastinka) suyuqlikka 20 mkl Bufer ST qo'shiladi (1-3-jadvalda ko'rsatilgan miqdorda qo'shilgan turli lizis tizimlari Bufer ST), 5-10 marta takroriy pipetleme, xona haroratida (20-25 ℃) 2 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi.

Eslatma:Pipetka uchi lizat qo'shilganligini ta'minlash uchun sirt ostiga joylashtirilgan,pufakchalar paydo bo'lishiga yo'l qo'ymaslik uchun pipetka shkalasi 200 mkl yoki undan kamroq qilib sozlanganda iltimos.

1-3-jadval:Buffer ST qo'shing

5.Lizat keyingi RT-qPCR tajribalari uchun ishlatiladi.Agar keyingi tajribalarni o'z vaqtida bajarib bo'lmasa, iltimos, uni muz ustida 2 soatdan ko'p bo'lmagan vaqt davomida saqlang va -20 ℃ yoki -80 ℃ (uch oydan ko'p bo'lmagan) haroratda saqlang.

B: RT tizimini tayyorlash

1.5 × Direct RT Mixni chiqarib oling va uni muzli hammomga qo'ying, tabiiy ravishda eritib yuboring va keyinroq ishlatish uchun muloyimlik bilan aralashtiring;RNase-Free ddH2O ni chiqarib oling va uni eritib, keyinroq ishlatish uchun muz hammomiga qo'ying.Quyidagi 2-1-jadvalga muvofiq muz ustidagi reaksiya tizimini tayyorlang.

2-1-jadval: RT reaksiya tizimini tayyorlash

2.Tizimni shakllantirish tugagandan so'ng, asta-sekin aralashtiriladi va quyidagi jadvalda qisqacha santrifüj qilinadi 2 -2 reaktsiya shartlari RT reaktsiyasi.

2-2-jadval: RT Reaktsiya holatini sozlash

3. Reaksiya tugagandan so'ng, reaktsiya mahsuloti qPCR uchun to'g'ridan-to'g'ri muzga joylashtirildi, iltimos, uzoq muddatli saqlash -20 ℃ yoki -80 ℃ qo'ying.

Eslatma: Tozalanmagan shablondan foydalanish tufayli teskari transkripsiya mahsulotida oq cho'kma paydo bo'lishi mumkin.Bu oddiy hodisa.Keyingi tajribalar uchun supernatantni darhol santrifüj qiling.

Olingan RT reaksiya eritmasi keyingi Step Real Time PCR reaktsiya tizimlariga qo'shiladi, reaktsiya tizimining 10-30% gacha bo'lgan miqdorlarni qo'shish tavsiya etiladi.

C: qPCR reaktsiya tizimini tayyorlash

1. Reaksiya tizimini tayyorlash uchun quyidagi 3-1-jadvalga muvofiq bosqichli cDNK shablonida tayyorlangan B ning tegishli miqdori.

Eslatma: cDNK shablonining miqdori qPCR tizimining 10-30% ni tashkil qiladi.Masalan, 20 mkl qPCR tizimida 2-6 mkl lizis buferini qo'shing, lekin 6 mkl dan oshmasligi kerak.

2. qPCR reaktsiyasi uchun optimal qPCR shartlari (Tavlanish harorati va boshqalar) (reaksiya shartlari 3-2-jadvalda keltirilgan).

Eslatma: Yaxshiroq natijalarga erishish uchun qPCR reaktsiyalari uchun optimallashtirilgan sharoitlardan foydalanishga harakat qiling.

3-1-jadval: PCR reaksiya tizimini tayyorlash

1*: Primer kontsentratsiyasi 50-900 nM oralig'ida sozlanishi, agar primer reaktsiyasi yomon bo'lsa.

Eslatma: qPCR tizimi eksperimental ehtiyojlar va floresan tsikli modeliga muvofiq sozlanishi mumkin.50 da qPCR uchunμl tizimida reagent dozasini 20 ga muvofiq mutanosib ravishda sozlangμl tizimi.

2*: Flüoresan miqdoriy termal siklatorga muvofiq ROX Reference Dye mos keladigan yakuniy konsentratsiyasini tanlang.Keng tarqalgan floresan miqdoriy sikllar uchun eng mos ROX Reference Dye konsentrasiyalari quyidagi jadvalda ko'rsatilgan:

3-2-jadval: qPCR reaksiya shartlari keltirilgan

Eslatma: Eng yaxshi qPCR effektini olish uchun gradient PCR turli andozalar va turli primerlar uchun reaksiya sharoitlarini optimallashtirish uchun ishlatilishi mumkin.PCR reaktsiyasi shartlari floresan analizator, shablon, primer va boshqalarga qarab o'zgaradi. Muayyan operatsiyada optimal reaktsiya sharoitlari flüoresan miqdoriy termal siklatorning o'ziga xos shartlariga, shablon turiga, qiziqish bo'lgan fragmentning o'lchamiga, kuchaytirilgan fragmentning asosiy ketma-ketligiga va GC tarkibiga, shu jumladan reaktsiya vaqtining davomiyligiga, tavlanish vaqti va boshqalarga qarab ishlab chiqilishi kerak.

Real Time PCR primerini loyihalash tamoyillari

Oldinga astar va teskari astar

Real Time PCR uchun primer dizayni juda muhim.Primerlar PCR kuchaytirilishining o'ziga xosligi va samaradorligi bilan bog'liq bo'lib, ular quyidagi printsiplarga asoslanib ishlab chiqilishi mumkin:

◆ Astar uzunligi: 18-30bp.

◆ GC tarkibi: 40-60%.

◆ Tm qiymati: Primer 5 kabi primer dizayn dasturi primerning Tm qiymatini berishi mumkin.Yuqori va quyi oqim primerlarining Tm qiymatlari imkon qadar yaqin bo'lishi kerak.Tm hisoblash formulasidan ham foydalanish mumkin: Tm = 4 °C (G + C) + 2 ° C (A + T).PCRni o'tkazishda, odatda, 5 °C primer Tm qiymatidan past harorat tavlanish harorati sifatida tanlanadi (tavlanish haroratining mos kelishi PCR reaktsiyasining o'ziga xosligini oshirishi mumkin).

◆ Primerlar va PCR mahsulotlari:

◆ Dizayn primer PCR kuchaytiruvchi mahsulot uzunligi afzal 100-150bp.

◆ Shablonning ikkilamchi konstruktiv hududida dizayn astarlaridan iloji boricha qochish kerak.

◆ Yuqori va quyi oqim primerlarining 3′ uchlari oʻrtasida 2 yoki undan ortiq qoʻshimcha asoslar hosil boʻlishidan saqlaning.

◆ Primer 3′ terminal bazasi 3 ta qoʻshimcha ketma-ket G yoki C bilan boʻlishi mumkin emas.

◆ Primerlarning o'zlari bir-birini to'ldiruvchi tuzilmalarga ega bo'lolmaydi, aks holda PCR kuchaytirilishiga ta'sir qiluvchi soch tolasi tuzilishi hosil bo'ladi.

◆ ATCG primer ketma-ketlikda iloji boricha teng taqsimlanishi kerak va 3' terminal bazasi T sifatida oldini olish kerak.

Ilova1:Cell DirectRT-qPCR Komponent to'plamit qo'shimchalar to'plami

1. Hujayra lizis eritmasi