Ma'lumki, markaziy dogmada RNK DNK va oqsil ifodasi o'rtasidagi transkripsiya vositachisi hisoblanadi.DNKni aniqlash bilan solishtirganda, RNKni aniqlash organizmlarda gen ifodasini ob'ektivroq aks ettirishi mumkin.RNK ishtirokidagi eksperimentlarga quyidagilar kiradi: qRT-PCR, RNK-Seq va termoyadroviy genlarni aniqlash va boshqalar. RNKning o'ziga xos xususiyatlaridan kelib chiqqan holda (RNKning shakar halqasi DNKning shakar halqasiga qaraganda bitta ko'proq erkin gidroksil guruhiga ega), atrof-muhitdagi ko'p sonli RNazalar bilan birlashganda, RNK DNKga qaraganda ancha beqaror va oson parchalanadi.Axlat, axlat, agar RNK sifati yaxshi bo'lmasa, eksperimental natijalar qoniqarsiz bo'lishi kerak, xususan, noto'g'ri ma'lumotlar yoki yomon takrorlanuvchanlik sifatida namoyon bo'lishi kerak.Shu sababli, RNKni qayta ishlashga ko'proq e'tibor qaratish kerak va keyingi eksperimental ma'lumotlarning aniqligi va to'g'riligini ta'minlash uchun sifat nazorati aloqasi ham muhimroqdir.

RNK sifatini nazorat qilish uchun odatda quyidagi keng tarqalgan usullar mavjud:

• Spektrofotometriya
• agaroz gel elektroforezi
• Agilent bioanalizator
• real vaqtda lyuminestsent miqdoriy PCR
• Qubit floresan bo'yoq usuli

01 Spektrofotometriya

RNK konjugatsiyalangan qo'sh bog'larga ega va 260nm to'lqin uzunligida yutilish cho'qqisiga ega.Lambert-Beer qonuniga ko'ra, biz RNK kontsentratsiyasini 260 nmdagi yutilish cho'qqisidan hisoblashimiz mumkin.Bundan tashqari, biz RNKning tozaligini 260nm, 280nm va 230nm assimilyatsiya cho'qqilarining nisbati bo'yicha ham hisoblashimiz mumkin.280nm va 230nm mos ravishda oqsillar va kichik molekulalarning yutilish cho'qqilaridir.A260/A280 va A260/A230 ning malakali RNK tozaligi nisbati 2 dan katta bo'lishi kerak. Agar u 2 dan kam bo'lsa, bu RNK namunasida oqsil yoki kichik molekulali ifloslanish borligini va uni qayta tozalash kerakligini bildiradi.Kontaminatsiya manbalari PCR reaktsiyalarining kuchaytirish samaradorligini inhibe qilish kabi quyi oqim tajribalariga ta'sir qiladi, bu esa noto'g'ri miqdoriy natijalarga olib keladi.RNKning tozaligi keyingi natijalarga katta ta'sir ko'rsatadi, shuning uchun spektrofotometriya odatda nuklein kislotasi tajribalarining birinchi bosqichida sifatni nazorat qilishning ajralmas bo'g'ini hisoblanadi.

Shakl 1. Odatda RNK/DNK yutilish spektri

02 Agaroz gel elektroforezi

Soflikdan tashqari, RNKning yaxlitligi ham RNK sifatini baholash uchun muhim ko'rsatkichlardan biridir.RNKning parchalanishi namunadagi ko'p sonli qisqa fragmentlarga olib keladi, shuning uchun samarali aniqlanishi va mos yozuvlar ketma-ketligi bilan qoplanishi mumkin bo'lgan RNK fragmentlari soni kamayadi.RNKning yaxlitligini 1% agaroz jelida umumiy RNKning elektroforezi orqali tekshirish mumkin.Ushbu usul jelni o'zingiz sozlashingiz yoki yaxlitlikni tekshirish uchun tayyor E-Gel™ tizimidan foydalanishingiz mumkin.Umumiy RNKning 80% dan ortigʻi ribosoma RNK boʻlib, ularning koʻp qismi 28S va 18S rRNKdan iborat (sutemizuvchilar tizimida).Yaxshi sifatli RNK ikkita aniq yorqin chiziqni ko'rsatadi, ular mos ravishda 5 Kb va 2 Kb da 28S va 18S yorqin chiziqlar bo'lib, nisbati 2: 1 ga yaqin bo'ladi.Agar u diffuz holatda bo'lsa, bu RNK namunasi degradatsiyaga uchragan bo'lishi mumkinligini anglatadi va RNK sifatini qo'shimcha tekshirish uchun keyinroq tavsiflangan usuldan foydalanish tavsiya etiladi.

Shakl 2. Agaroz gel elektroforezida degradatsiyaga uchragan (2-qator) va buzilmagan RNK (3-qator) ni solishtirish

03 Agilent bioanalizatori

RNKning yaxlitligini oddiy va tez aniqlashga yordam beradigan yuqorida tavsiflangan agaroz gel elektroforez usulidan tashqari, RNK yaxlitligini aniqlash uchun Agilent bioanalizatoridan ham foydalanishimiz mumkin.RNK kontsentratsiyasi va yaxlitligini baholash uchun mikrofluidika, kapillyar elektroforez va floresans kombinatsiyasidan foydalanadi.RNK namunasi profilini tahlil qilish uchun o'rnatilgan algoritmdan foydalangan holda, Agilent bioanalizatori mos yozuvlar RNK yaxlitligi qiymatini, RNK yaxlitlik raqamini (bundan buyon matnda RIN deb yuritiladi) hisoblashi mumkin [1].RIN qiymati qanchalik katta bo'lsa, RNKning yaxlitligi shunchalik yuqori bo'ladi (1 juda buzilgan, 10 eng to'liq).RNKni o'z ichiga olgan ba'zi tajribalar sifatni baholash uchun parametr sifatida RIN dan foydalanishni taklif qiladi.Yuqori o'tkazuvchanlikdagi ketma-ketlik tajribalarini (keyingi o'rinlarda NGS deb yuritiladi) misol tariqasida oladigan bo'lsak, Thermo Fisherning Oncomine paneli seriyasida B hujayra va T hujayra antijeni retseptorlarini aniqlash uchun foydalaniladigan Oncomine ™ Inson Immunitet Repertuarining ko'rsatmalari RIN qiymatlari 4 dan yuqori bo'lgan namunalarni o'qish va ko'proq samarali o'lchash mumkinligini ko'rsatadi.Turli panellar uchun tavsiya etilgan turli diapazonlar mavjud va ko'pincha yuqori RIN yanada samarali ma'lumotlarni keltirishi mumkin.

3-rasm, Oncomine™ Human Immune Repertuire tajribalarida RIN 4 dan yuqori bo'lgan namunalar samaraliroq o'qish va T hujayralari klonlarini aniqlay oladi.【2】

Biroq, RIN qiymati ham ba'zi cheklovlarga ega.RIN NGS eksperimental ma'lumotlarining sifati bilan yuqori korrelyatsiyaga ega bo'lsa-da, u FFPE namunalari uchun mos emas.FFPE namunalari uzoq vaqt davomida kimyoviy ishlov berilgan va olingan RNK odatda nisbatan past RIN qiymatiga ega.Biroq, bu tajribaning samarali ma'lumotlari qoniqarsiz bo'lishi kerak degani emas.FFPE namunalarining sifatini to'g'ri baholash uchun biz RINdan boshqa o'lchovlardan foydalanishimiz kerak.RINdan tashqari, Agilent bioanalizatori RNK sifatini baholash parametri sifatida DV200 qiymatini ham hisoblashi mumkin.DV200 - RNK namunasidagi 200 bp dan katta bo'laklarning ulushini hisoblaydigan parametr.DV200 FFPE namunasi sifatining RINga qaraganda yaxshiroq ko'rsatkichidir.FFPE tomonidan chiqarilgan RNK uchun u samarali aniqlanishi mumkin bo'lgan genlar soni va genlarning xilma-xilligi bilan juda yuqori korrelyatsiyaga ega [3].DV200 FFPE sifatini aniqlashdagi kamchiliklarni to'ldirishi mumkin bo'lsa-da, Agilent bioanalizatori RNK namunalaridagi sifat muammolarini, shu jumladan namunalarda ingibitorlar bor-yo'qligini hali ham har tomonlama tahlil qila olmaydi.Inhibitorlarning o'zlari quyi oqim tajribalarining kuchaytirish samaradorligiga ta'sir qilishi va foydali ma'lumotlar miqdorini kamaytirishi mumkin.Namunada inhibitor bor yoki yo'qligini bilish uchun biz keyingi tasvirlangan real vaqtda lyuminestsent miqdoriy PCR usulini qo'llashimiz mumkin.

04 real vaqtda lyuminestsent miqdoriy PCR

Haqiqiy vaqtda lyuminestsent miqdoriy PCR usuli nafaqat namunadagi ingibitorlarni aniqlabgina qolmay, balki FFPE namunasidagi RNK sifatini ham aniq aks ettirishi mumkin.Agilent biologik analizatorlari bilan solishtirganda, real vaqtda floresan miqdoriy asboblar kengroq qo'llanilishi tufayli yirik biologik laboratoriyalarda ko'proq mashhur.RNK namunalarining sifatini tekshirish uchun biz faqat GUSB (Mushuk no. Hs00939627) kabi ichki mos yozuvlar genlari uchun primer problarni sotib olishimiz yoki tayyorlashimiz kerak.Mutlaq miqdoriy tajribalarni o'tkazish uchun ushbu primerlar, zondlar va standartlar (ma'lum konsentratsiyaning umumiy RNK) to'plamidan foydalanib, RNK fragmentining samarali kontsentratsiyasini RNK sifatini baholash standarti sifatida hisoblash mumkin (qisqacha Funktsional RNK miqdori (FRQ)).NGS testida biz RNK namunalarining FRQ samarali ma'lumotlar hajmi bilan juda yuqori korrelyatsiyaga ega ekanligini aniqladik.0,2ng/uL FRQ dan katta bo'lgan barcha namunalar uchun o'qishlarning kamida 70% mos yozuvlar ketma-ketligini samarali qoplashi mumkin (4-rasm).

4-rasm, floresan miqdoriy usuli bilan aniqlangan FRQ qiymati NGS tajribasida olingan samarali ma'lumotlar bilan juda yuqori korrelyatsiyaga ega (R2>0,9).Qizil chiziq FRQ qiymati 0,2 ng/uL ga teng (log10 = -0,7).【4】

FFPE namunalariga qo'llanilishidan tashqari, real vaqt rejimida PCR usuli ham namunalardagi inhibitorlarni samarali kuzatishi mumkin.Biz aniqlanishi kerak bo'lgan namunani ichki pozitiv nazorat (IPC) va uning tahlili bilan reaktsiya tizimiga qo'shishimiz va keyin Ct qiymatini olish uchun floresan miqdorini aniqlashimiz mumkin.Agar namunasiz reaksiyada Ct qiymati Ct qiymatidan orqada qolsa, bu ingibitor namunada mavjudligini bildiradi va reaksiyada kuchaytirish samaradorligini inhibe qiladi.

05 Qubit floresan bo'yoq usuli

Qubit florometr nuklein kislota kontsentratsiyasi va tozaligini aniqlash uchun eng ko'p ishlatiladigan kichik qurilma bo'lib, uni ishlatish oson va deyarli har bir molekulyar biologiya laboratoriyasida mavjud.Nuklein kislotasi kontsentratsiyasini aniqlash va nuklein kislotani bog'laydigan floresan bo'yoq (Qubit aniqlash reagenti) orqali aniq hisoblab chiqadi.Qubit yuqori sezuvchanlik va o'ziga xoslikka ega va RNKni pg/µL kontsentratsiyasigacha aniq o'lchashi mumkin.Nuklein kislota kontsentratsiyasini aniq aniqlash qobiliyatiga qo'shimcha ravishda, Thermo Fisherning so'nggi yangi modeli Qubit 4.0 ham RNKning yaxlitligini aniqlay oladi.Qubit 4.0 RNKni aniqlash tizimi (RNK IQ tahlili) bir vaqtning o'zida ikkita maxsus floresan bo'yoqlarni aniqlash orqali RNKning yaxlitligini aniqlaydi.Ushbu ikkita lyuminestsent bo'yoq mos ravishda RNKning katta bo'laklari va kichik bo'laklari bilan bog'lanishi mumkin.Ushbu ikkita lyuminestsent bo'yoq namunadagi katta RNK bo'laklarining ulushini ko'rsatadi va bundan RNK sifatini ifodalovchi IQ (Yaxlitlik va Sifat) qiymatini hisoblash mumkin.IQ qiymati FFPE va FFPE bo'lmagan namunalar uchun ham amal qiladi va keyingi ketma-ketlik sifatiga katta ta'sir ko'rsatadi.NGS tajribalarini misol tariqasida oladigan bo‘lsak, Ion torrent™ platformasida o‘tkazilgan RNK-Seq test tajribalarida IQ qiymati 4 dan yuqori bo‘lgan ko‘pchilik namunalar kamida 50% samarali o‘qishga ega bo‘lgan (5-rasm).Yuqorida aytib o'tilgan aniqlash usullari bilan solishtirganda, Qubit IQ Assay nafaqat ishlash uchun qulayroq va kamroq vaqt talab etadi (besh daqiqa ichida), balki o'lchangan parametr IQ qiymati va quyi oqim eksperimentlarining ma'lumotlar sifati o'rtasida katta bog'liqlikka ega.

5-rasm, Qubit RNK IQ qiymati va RNK-Seqning xaritalangan ko'rsatkichlari o'rtasida katta bog'liqlik mavjud.【5】

Yuqoridagi kirish orqali men har bir kishi RNK sifatini nazorat qilishning turli usullari haqida yetarlicha tushunchaga ega ekanligiga ishonaman.Amalda, siz tanlashingiz mumkinnamuna turiga va mavjud asboblarga mos keladigan usul.Faqatgina RNK sifatini yaxshi nazorat qilish orqali biz namuna sifati pastligi tufayli keyingi tajribalarning muvaffaqiyatsizligidan qochishimiz mumkin, bu esa qimmatli vaqt, energiya va xarajatlarni tejash imkonini beradi.

Yo'naltiruvchi mahsulotlar:

Hayvonlarning umumiy RNK izolyatsiyasi to'plami

Hujayra umumiy RNK izolyatsiyasi to'plami

havolalar

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. va boshqalar.RIN: RNK o'lchovlariga yaxlitlik qiymatlarini belgilash uchun RNK yaxlitlik raqami.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine inson immuniteti repertuaridan foydalanuvchi qoʻllanmasi (nashr. № MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brayan N Chorley, Carole L Yauk, Geil M Nelson, Susan D Hester, Arxiv formalin bilan mahkamlangan kerosin o'rnatilgan to'qimalar namunalaridan olingan RNKni baholash uchun kengaytirilgan sifat ko'rsatkichlari, Toksikologiya fanlari, 170-son, avgust 12, 19-betlar, 7–373,https://doi.org/10.1093/toxsci/