1. Dastlabki tushunish
Ushbu bosqichda biz ba'zi qarindoshlarimiz oldida xatolarni amalga oshirmaslik uchun ba'zi tushunchalar va terminologiyani tushunishimiz kerak.
Savol: RT-PCR, QPCR, Real vaqtli PCR va RT-PCR o'rtasidagi farq nima?
Javob: RT-PCR teskari transkript PCR(Transka-tranziter PCR-PCR) polimerase zanjiri reaktsiyasi (PCR).RT-PCRda RNN strand teskari tomon buralib boradi, u keyinchalik DNK tomonidan DNK kuchaytirish uchun shablon sifatida ishlatiladi.
Real vaqt-PCR va QPRCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) bir xil narsadir, ikkalasi ham real vaqtda miqdoriy PCR hisoblanadi, ya'ni PCRning har bir siklida real vaqtda ma'lumotlar yozuvlari mavjud, shuning uchun boshlang'ich shablonlar soni aniq tahlilni sozlashi mumkin.
Garchi ikkala real vaqtli PCR (real vaqtli flident miqdoridagi PRCR) va teskari transkripsiya PCR-PCR tomonidan qisqartirilgan ko'rinadi: RT-PCR Transpriptni o'zgartiradiPRCR, real vaqt rejimida, odatda QPRC (miqdoriy real vaqtda PCR).
Va real vaqtda RT-PCR (RT-QPCR), bu "Fleansent" miqdoriy texnologiyasi bilan birgalikda teskari transkripsiya: Avval CNA teskari transkriptdan CNN (RT) oling va keyin miqdorni miqdoriy tahlil qilish uchun real vaqt rejimidan foydalaning.Ko'pgina laboratoriyalar RT-qPCR, ya'ni RNK ifodasini pastga tartibga solish bo'yicha tadqiqotlar olib boradi, shuning uchun laboratoriyada hamma gapiradigan qPCR aslida RT-qPCRga ishora qiladi, ammo klinik ilovalarda hali ham ko'plab DNK testlari mavjudligini unutmang.Gepatit B virusi HBVni aniqlash kabi miqdoriy tahlil.
Savol: Flenensent miqdorini o'qib chiqqandan so'ng, 30-300 mp oralig'ida kuchaytirilgan parcha kerakmi?
Javob: Har bir gen ketma-ketligining uzunligi har xil, ba'zilari bir necha kb, ba'zilari yuzlab bp, lekin biz faqat primerlarni loyihalashda mahsulot uzunligi 80-300bp bo'lishini talab qilishimiz kerak, juda qisqa yoki juda uzun floresan miqdoriy PCR aniqlash uchun mos emas.Mahsulot parchasi asta-nichdan ajratish uchun juda qisqa.Primer-dimerning uzunligi taxminan 30-40bp ni tashkil qiladi va agar u 80bp dan kam bo'lsa, u primer-dimer yoki mahsulot ekanligini farqlash qiyin.Agar mahsulot fragmenti juda uzun bo'lsa, 300bp dan oshsa, u osonlikcha past kuchaytirish samaradorligiga olib keladi va gen miqdorini samarali aniqlay olmaydi.
Masalan, sinfda qancha odam borligini hisoblashda, siz qancha og'iz borligini hisoblashingiz kerak.Genlarni aniqlaganingizda ham xuddi shunday, siz butun ketma-ketlikni ifodalash uchun faqat genning ma'lum bir ketma-ketligini aniqlashingiz kerak.Agar siz odamlarni sanashni istasangiz, siz ham og'izni, burunlarini, quloqlarini va ko'zoynaklarni hisoblashingiz kerak va xato qilish juda oson.
Kengaytirish uchun biologik tadqiqotlarda nuqtadan hududga ko'plab tadqiqot holatlari mavjud, chunki har qanday turning gen ketma-ketligi juda uzun bo'lib, barcha bo'laklarni, masalan, bakterial 16S sekvensiyasini o'lchash kerak emas va imkonsizdir, bu bakteriyalarning konservativ ketma-ketligini amalga oshirishdir.
Savol: QPCR fster dizayni uchun eng maqbul uzunlik qaysi?
Javob: Umuman olganda, astar uzunligi 20-24bp ni tashkil qiladi, bu yaxshiroq.Albatta, biz primerni loyihalashda primerning TM qiymatiga e'tibor berishimiz kerak, chunki bu optimal tavlanish harorati bilan bog'liq.Ko'pgina tajribalardan so'ng, 60 ° C yaxshiroq TM qiymati ekanligi isbotlangan.Agar yumshatish harorati juda past bo'lsa, bu osonlikcha o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirilishiga olib keladi.Agar aenealist harorat juda yuqori bo'lsa, kuchaytirish samaradorligi nisbatan past bo'ladi, keyinchalik kuchaytirish egri cho'qqisining cho'qqisi kechiktiriladi va KT qiymati kechiktiriladi.
Savol: Bo'yoq usulida probning usulidan qanday farq qiladi?
Javob: bo'yoq usuliSYRIN GRAB, Picogren, Beba va boshqalar kabi ba'zi lug'atli bo'yoqlar, o'zlari bilan yorug'lik chiqarmang, lekin voyaga etmagan DNKning mayda-chuyda derani bog'lab qo'yadi.Shuning uchun, PCR reaktsiyasining boshida mashina floresan signalni aniqlay olmaydi.Reaktsiya yumshatish-uzaytiruvchi bosqichga etib borganda, DNK polimerazasi ta'sirida yangi iplar, dsonsiz molekulasida dsdna voyaga etmaydi.PCR tsikllari soni ortib borar ekan, tobora ko'proq bo'yoqlar ikki bardoshli DNK bilan birlashtirilgan va lyumesan signali ham doimiy ravishda oshiriladi.Bo'yoq usuli asosan ilmiy tadqiqotlarda qo'llaniladi.
PS: Tajribani o'tkazishda ehtiyot bo'ling, bo'yoq inson DNKsi bilan birlashtirilishi kerak, uni floresan odamga aylantirish uchun ehtiyot bo'ling.
Bo'yoq usuli (chapda) tekshiruv usuli (o'ngda)
PS: Tajribani o'tkazishda ehtiyot bo'ling, bo'yoq inson DNKsi bilan birlashtirilishi kerak, uni floresan odamga aylantirish uchun ehtiyot bo'ling.
SYR Yashil DNKning mayda-chuyda mirgi bilan bog'laydi
Prob usuliTaqman Probe eng keng tarqalgan gidroliz tekshiruvidir.Odatda famunanning 5-yillarida, probedient guruhi mavjud, ammo probning o'zi maqsadli gen uchun qo'shimcha ravishda qo'shimcha ravishda to'ldirilgan ketma-ketdir.3 'uchida flörizning qon ketish guruhi mavjud."Florencececececeessing Energiya uzatilishi" printsipiga ko'ra, spektakl zonchaxonni (7-10 sm) qisman (7-10 sm) va xirillagandan so'ng, donor molekulasining qo'zg'alishi, Autofluorececence-ning qo'zg'alishini keltirib chiqaradi. zaiflashgan.Shuning uchun, PRCR reaktsiyasining boshida, prob, Tizim erkin va tartibsiz bo'lsa, muxbirli flondorlar guruhi floresan chiqarmaydi.Qachon egealing bo'lsa, primer va shablonni bog'lash.Kengaytirilgan bosqichda polimeraza yangi zanjirlarni doimiy ravishda sintez qiladi.DNK polimerazasi 5'-3 "3" eksponenzasiz faoliyatiga ega.Probulyatsiyaga erishishda DNK polimerase shablondan olingan probeazni gidrolizatsiya qiladi, reportachi guruhni qondan yasalgan signalni ajratadi va floresan signalni chiqaradi.Prob va shablon o'rtasida bir-biriga to'g'ri munosabat mavjud bo'lganligi sababli, sinov usuli sinovning aniqligi va sezgirligi nuqtai nazaridan bo'yoq usulidan ustundir.Prob usuli asosan tashxisda qo'llaniladi.
Savol: Mutlaquv miqdorini nima?Nisbiy miqdorni nimada?
Javob: Mutlaquv miqdorini qisqartirish uchun QPRC tomonidan sinovdan o'tkazilishi uchun namunaning dastlabki nusxasini hisoblash, masalan, 1mlon qonda bo'lgan.Qisqa miqdorini aniqlash natijasida olingan natijada boshqa bir ma'lumot namunalariga nisbatan ma'lum bir namunadagi o'zgarishi va gen ifodasi tartibga solinadigan yoki pastga yo'naltirilgan.
Savol: RNK ekstraktsiyasining miqdori, teskari transkripsiya samaradorligi va kuchaytirish samaradorligi eksperimental natijalarga ta'sir qiladimi?
Savol: Namunani saqlash, ekstraksiya reagentlari, teskari transkripsiya reagentlari va yorug'lik o'tkazuvchi sarf materiallari eksperimental natijalarga ta'sir qiladimi?
Savol: Eksperimental ma'lumotlarni qanday usul bilan tuzatish mumkin?
Ushbu muammolarga kelsak, biz ularni quyidagi ilg'or va ilg'or bo'limlarda batafsil bayon qilamiz.
2. Kengaytirilgan bilimlar
Haqiqiy vaqtli floresan miqdorini hisobga olgan holda, har yili minglab ilmiy tadqiqotlar nashr etilishi, ular orasida "Fleke" ning minglab miqdordagi PCC texnologiyasi unchalik katta emas.
Agar floresan miqdoriy PCR tajribasini o'lchash uchun umumiy standart mavjud bo'lmasa, natijalar juda katta farq qilishi mumkin.Xuddi shu turdagi bir xil gen uchun, qayta ishlash usuli bilan aniqlash natijalari ham farq qiladi va xuddi shu natijalarni takrorlash uchun kechikish qiyin bo'ladi.Hech kim bu to'g'ri va nima noto'g'ri ekanligini bilmaysiz.
Bu lyuminestsent miqdoriy PCR hiyla texnologiyasi yoki ishonchsiz texnologiya ekanligini anglatadimi?Yo'q, chunki flumensentning miqdoriy pcrity-ning eng aniq va aniqroq va bir oz noto'g'ri operatsiya mutlaqo teskari natijalarga olib keladi.Kichkina yo'qotish ming mil uzoqlikda.Maqola muallifi taqrizchilar tomonidan qayta-qayta qiynoqqa solinishi mumkin.Shu bilan birga, jurnalning sharhlovchilari turli eksperimental natijalardan tanlash qiyin.
Umuman olganda, real vaqtda PCR tajribalarida konsensus yo'qligiga ishora qilmoqda.Shu maqsadda sanoatning katta olimlari standartlarni shakllantirishni boshladilar,Ushbu standartlarga javob beradigan maqolada ba'zi zarur tajriba va ma'lumotlarni qayta ishlash tafsilotlarini (shu jumladan zarur ma'lumotlar bilan) taqdim etishni talab qiladi.
Ushbu tafsilotlarni o'qib sharhlovchilar tajriba sifatini baholashlari mumkin;Kelajakdagi o'quvchilar ham tajribani takrorlash yoki tajribani yaxshilash uchun undan foydalanishlari mumkin.Shu tarzda olingan tajriba natijalari ma'lumotga, yuqori sifatli va foydalanishga yaroqli.
Mibbi (biologik va biomitik tadqiqotlar uchun minimal ma'lumotlar -http://www.Mibbi.org) paydo bo'ldi.Mibbi - bu tajriba uchun standartlarni taqdim etadigan loyiha.Bu tabiatda chop etilgan.Ushbu loyiha turli xil biologik tajribalar, jumladan, hujayra biologiyasi, mikrayra, QDCR hozir muhokama qilmoqchimiz va hokazo, va qo'lyozmalarni topshirishda har bir tajriba turini taklif qilamiz.Bu ma'lumotlar har doim taqdim etilishi kerak.
MIBBI loyihasida flörensentning miqdoriga oid ikkita moddalar mavjud, ya'ni:
· Rdikult (real vaqt rejimidagi PRC ma'lumotlarini belgilash tili) - real vaqt rejimida aniqlangan PRC ma'lumotlari uchun tuzilgan til va hisobot qo'llanmasi;
· Miqe (eng kam real vaqtda PCR real vaqtli PCR tajribasini nashr qilish uchun minimal ma'lumot) - real vaqt rejimida pRCR tajribasi to'g'risida maqolalarni nashr etish uchun minimal ma'lumot.
Birinchidan, keling, terminologiya spetsifikatsiyasi bo'yicha RDML haqida gaplashaylik.
Agar hamma narsa uchun standart ta'rif bo'lmasa, munozarani davom ettirish mumkin emas, shuning uchun atamalarni tushuntirish imtihonda juda muhimdir.
Florensentning miqdoriy holatida ishlatiladigan terminologiya quyidagi tarkibni o'z ichiga oladi.Qiagen biz uchun eng yaxshi xulosaga keldi.Quyidagilar quruqtovarlar .
Kuchaytirish egri
Axtalashtirish egri pcret jarayoni davomida qilingan egri chizig'ini anglatadi, bu reaktsiya paytida reaktsiya paytida abscissa va real vaqtli ftorcecencecenceenceenquenziya sifatida.
Zo'r kuchaytiriladigan egri chiziq quyidagi xususiyatlarga ega bo'lishi kerak: Asorat tekis yoki biroz kamaydi va yuqoriga ko'tarilgan tendentsiya yo'q;egri chiziqning inflyatsiya nuqtasi aniq va eksponensial bosqich qiyaligi kuchaytirish samaradorligiga mutanosibdir.Quvish darajasi qanchalik katta bo'lsa, kuchaytirish samaradorligi qanchalik yuqori bo'lsa;Parallelizmning umumiy kuchaytirilishi egilishi yaxshi, shuni ko'rsatadiki, har bir naychaning kuchaytirilishi o'xshashligini ko'rsatadi;Kam konsentratsiya namunalarining eksplepatsion bosqichi aniq.
Boshlang'ich (bazali)
Asorat - bu erta tsiklning shovqin darajasiOdatda 3-15-chi tsikl o'rtasida o'lchanadi, chunki bu davrda kuchaytirish mahsuloti ko'tarilgan mahsulotning o'sishi aniqlanmaydi.Asllashtirish uchun ishlatiladigan tsikllar soni turlicha bo'lishi mumkin va agar yuqori shablon miqdori ishlatilsa yoki maqsadli genning ifoda darajasi yuqori bo'lsa, kamayishi mumkin.
Boshlang'ichni o'rnatish kerak, lyunoresencecencecesence ma'lumotlarini chiziqli kuchaytirish egri-dan ko'rish talab etiladi.Asl ildiz stolining o'sishi tsikl raqami yuqori sonidan kattaroq bo'lgan tsikl raqami bilan boshlanadi.Har bir maqsad ketma-ketligi uchun alohida-alohida o'rnatilishi kerak.Dastlabki tsikllarda aniqlangan o'rtacha floresan qiymatlari kuchaytirilgan mahsulotlarda olingan fynaceence qiymatlaridan ajratilishi kerak."Real vaqt" PRCE-ning so'nggi versiyalarining so'nggi versiyalari individual namunalar uchun boshlang'ich parametrlarini avtomatik ravishda optimallashtirishga imkon beradi.
PCCning kuchaytirilgan reaktsiyasining dastlabki bir necha tsiklida floresancence signallari ko'p narsani o'zgartirmaydi.To'g'ri chiziqqa yaqinlashish bu boshlang'ich deb ataladi, ammo agar biz dastlabki bir necha tsiklga diqqat bilan qarasak, quyidagi rasmda ro'y berayotgan narsa.
Fon fonati
reaktsiyada o'ziga xos bo'lmagan suyuqlikning qiymati.Masalan: mozaikaning samarasiz florentence;yoki SYBR yashildan foydalanish tufayli ko'p sonli shablon shablonlari shablonlari.Signalning fon tarkibiy qismlari real vaqt rejimida PCR dasturiy ta'minot algoritmi bilan bog'liq.
Muxbir signali
Muxbir signallari SYR yashil yoki flodeksiallashtirilgan "Real vaqt rejimida ketma-ket probeksiallashtirilgan premyumeni tomonidan ishlab chiqarilgan" Fransuz "tugmachasini anglatadi.
Normallashtirilgan muxbir signali (RN)
RN har bir tsiklda o'lchanadigan passiv moslamaning floresan sog'sining floresan sog'sining floresan namoyishi intensivligi bilan bo'linadi.
Passiv ma'lumotli bo'yoq
Ba'zi real vaqtda PCRlarda,Floruminli bo'yoq Rox fleorsonent signalini normalizatsiya qilish uchun ichki ma'lumot sifatida ishlatiladi.Noto'g'ri quvurlar, pozitsiyaning pozitsiyasi va yaxshi asosda floresan tebranishlar tufayli o'zgarishlarni anglatadi.
Florecence osti osti (chegarasi)
fon qiymati yuqorida va kuchaytirilgan egri chiziqning platosi narxidan ancha past.Bu PCR chizish chizig'ining liniyali diapazonini aks ettirgan kengaytirish egri chizig'ining chiziqli mintaqasida yotishi kerak.PCR chizmali bosqichi osonlikcha identifikatsiya qilinishi uchun uni strelkali egri chizig'iga qarab o'rnatilishi kerak.Agar real vaqtda PCR real vaqt rejimida bir nechta maqsadli gen mavjud bo'lsa, har bir maqsadga belgi qo'yish kerak.Umuman olganda, PCRning dastlabki 3 tsiklining floreonesence signalidan foydalaniladi.Umuman olganda, har bir asbobdan foydalanishdan oldin uning floresan tebranish ostonchasi bor.
Tsiklni (CT) yoki o'tish joyini (CP)
Atrofilik egri chiziqni kesib o'tgan tsikl (ya'ni florecencececementni aniqlash nuqtasini ortib borayotgan joy).CT fraktsiya bo'lishi mumkin va boshlang'ich shablon miqdorini hisoblash mumkin.CT qiymati har bir PCRESESED signalining har bir qismida joylashgan floresan signallar to'plamga yetganda, tsikllar sonini anglatadi.CTning har bir shabloni va shablonning dastlabki nusxasi logarifm orasidagi chiziqli munosabatlar mavjudDastlabki nusxa raqami, KT qiymatidan kichikroq va aksincha.Standart egri boshlang'ich nusxa raqami bilan standart yordamida amalga oshirilishi mumkin, unda abkissa CT qiymatini anglatadi va belgi dastlabki nusxa raqamining logarifmini anglatadi.Shuning uchun noma'lum namunaning CT qiymati olinayotgan bo'lsa, namunaning dastlabki nusxasi standart egrilagichdan hisoblash mumkin.
DRT qiymati
DTT qiymatlari tavsiflanadiMaqsadli gen va tegishli ennogen havolasi genigi CT qiymati orasidagi farq, masalan, uy xo'jaligi geni kabi va ishlatiladigan shablon miqdorini normallashtirish uchun ishlatiladi:
⇒NCT = CT (maqsad geni) - KT (endogen ma'lumot geni)
DDCT qiymati
DDCT qiymatini (masalan, rag'batlantiruvchi hujayralar) va o'rtacha o'lchamdagi farqni tavsiflaydi.Malum namunasi, shuningdek, kalibrlash namunasi va boshqa barcha namunalar bu haqda nisbiy miqdorga chiqarish uchun normallashtiriladi:
⇒DDCT = O'rtacha DTT (foiz namuna) - o'rtacha drt (mos yozuv namuna)
Endogen ma'lumotli genlar (endogen ma'lumot genlari)
Uy-joy garovi genlari kabi endogen ma'lumotlarning (uy-joy vbesi) kabi ifodalarning ifoda darajasi namunalar orasida farq qilmaydi.Maqsadli gen uchun kT qiymatlarini taqqoslash maqsadli genning ifoda darajasini kiritish uchun RNA yoki CDNA-dagi bo'limni shakllantirishga imkon beradi (yuqoridagi Navbatdagi bo'limga qarang).
Ichki ma'lumot genlari uchun to'g'riRNK namunalarida, shuningdek RNN tarkibidagi inhiberallar, teskari transkripsiya samaradorligi, nuklon kislotasini tiklash va namunaviy ishlov berishning o'zgarishi mumkin.Optimal havola genlarini tanlash uchun, biz eksperimental holatga bog'liq bo'lgan maqbul ma'lumotni tanlashiga imkon berish uchun algoritmni o'zgartirdik.
Ichki nazorat
Maqsad ketma-ketligi sifatida bir xil reaktsiyada kuchaytirilgan va boshqacha prection (ya'ni dublbog 'ijro etuvchi) bilan bog'liq bo'lgan boshqaruv ketma-ketligi.Ichki boshqarish vositalari ko'pincha muvaffaqiyatsiz almashinuvlarni boshqarish uchun ishlatiladi, masalan maqsad ketma-ketligi aniqlanmasa.
Kalibrlash namunasi
Ma'lumot namunalari (masalan, hujayra chizig'idan yoki to'qimadan tozalangan RNK) boshqa namunalarni jinning nisbiy ifodasi darajasini aniqlash uchun boshqa barcha namunalarni solishtirish uchun ishlatiladi.Kalibrlash namunasi har qanday namuna bo'lishi mumkin, lekin odatda nazorat hisoblanadi (masalan, ishlov berilmagan namuna yoki tajribaning nol vaqtidagi namuna).
Ijobiy boshqarish vositalari
boshqaruv reaktsiyalaridan foydalaningAndoza miqdori ma'lum miqdorda.Ijobiy boshqarish vositalari ko'pincha primer to'plam yoki primer-probe to'plamlari to'g'ri ishlayotganligini va reaktsiya to'g'ri o'rnatilganligini tekshirish uchun ishlatiladi.
Shablon nazorati yo'q (NTC)
Odatda suv bilan almashtiriladigan shablondan tashqari kuchaytiruvchi reaktsiyaning barcha kerakli komponentlarini o'z ichiga olgan nazorat reaktsiyasi.NTC dan foydalanish reagentning ifloslanishi yoki begona DNKdan kelib chiqqan ifloslanishni topishi mumkin, bu esa aniqlash ma'lumotlarining haqiqiyligi va ishonchliligini ta'minlaydi.NTC boshqaruvining kuchaytirilishi ifloslanishni ko'rsatadi.
RT boshqaruvi yo'q (NRT)
RNK ekstraktsiya jarayonida qoldiq genomik DNK bo'lishi mumkin, bu juda zararli va ma'lumotlar sifatiga ta'sir qiluvchi aybdor va qPCR ning tabiiy dushmani, shuning uchun tajribalarni loyihalashda u faqat RNKni aniqlashni kuchaytirish uchun mo'ljallangan bo'lishi kerak.Ikkita yo'l bor, biri intronlar bo'ylab primerlarni loyihalash, ikkinchisi DNKni butunlay olib tashlash, qaysi biri yaxshiroq, keyinroq muhokama qilinadi.NTR boshqaruvi DNK ifloslanishini aniqlash uchun sehrli oyna.Agar kuchaytirish bo'lsa, bu ifloslanish mavjudligini anglatadi.
Standartlar
Standartlar - bu standart egri chizish uchun ishlatiladigan kontsentratsiya yoki nusxa ko'chirish raqami.Standartning barqarorligini ta'minlash uchun gen parchalari odatda plazmidga va standart sifatida ishlatiladi.
Standart egri
odatda ikki barobar nisbati bo'yicha standart mahsulot bilan kamida 5 kontsentratsiya gradientiga suyultiriladi va CT qiymati va nusxa ko'chirish raqamining koordinatalarida 5 nuqta chiziladi va nuqtalar standart egri hosil qilish uchun chiziq hosil qilish uchun ulanadi.Har bir standart egri chizig'i uchun uning haqiqiyligi tekshirilishi kerak.Nishablanish qiymati -3.3.3 va -3.8 oralig'ida va har bir kontsentratsiya uch nusxada amalga oshiriladi.Boshqa nuqtalardan sezilarli darajada farq qiladigan nuqtalarni tashlashtirish kerak.Sinov qilinadigan namunaning KT qiymati standart egri chiziqqa keltiriladi va sinovdan o'tkaziladigan namunaning ifoda darajasini hisoblash mumkin.
Sinov qilinadigan namunaning KT qiymati standart egri chiziqqa keltiriladi va sinovdan o'tkaziladigan namunaning dastlabki nusxasi raqamini hisoblash mumkin.
Samaradorlik va qiyalik
Standart egri chiziqning qiyaligi real vaqt rejimining samaradorligini anglatadi.
· Nishab -3,322 PCR kuchaytirish samaradorligi 1 yoki 100% samarali ekanligini va har bir siklda PCR mahsuloti miqdori ikki baravar oshishini ko'rsatadi.
· 3.322 dan kam qiyalik (masalan, -3.8) pcce samaradorligini anglatadi
· Nishab -3,322 dan kattaroq (masalan, –3,0) PCR samaradorligi 100% dan yuqori ekanligini ko'rsatadi, bu qiziq, PCRning bir sikli qanday qilib kuchaytirilgan mahsulotdan ikki baravar ko'proq hosil bo'lishi mumkin?Ushbu holat PCR reaktsiyasining chiziqli bo'lmagan bosqichida sodir bo'ladi, ya'ni juda ko'p bo'lmagan qo'shimcha kuchaytirish mavjud.
egri egri
QDCR kuchaytirish tugagandan so'ng, PCR mahsuloti isitiladi.Harorat ko'tarilganda, ikki tomonlama kuchaytirish mahsuloti asta-sekin eriydi, natijada floresancenceence intensivligining pasayishiga olib keladi.Ma'lum bir harorat (TM) ga erishilganda ko'p miqdordagi mahsulotlar eriydi.Florecence keskin tushadi.Turli xil PCR mahsulotlari turli xil TM qiymatlari va turli xil eritish haroratiga ega, shuning uchun PCRning o'ziga xosligi aniqlanishi mumkin.
Erigan egri (lotivli egri)
Eritilgan egri cho'qqisiga ega bo'lgan eng yuqori xaritani shakllantirish uchun olingan, bu esa PCR mahsulotlari bo'laklarining holatini yanada sezilarli ravishda namoyish qilishi mumkin.Muzati harorati DNK parametrining TM qiymati, DNK tarkibiga ta'sir qiladigan ba'zi parametrlar, masalan, armer dizayn printsiplariga ko'ra,Kattalashtirilgan mahsulotning uzunligi 80-300bp oralig'ida, shuning uchun erish harorati 80 ° C va 90 ° C gacha bo'lishi kerak.
Eritilgan egri chiziqni sharhlash: Agar 80 ° C-90 ° C orasida faqat asosiy cho'qqisi paydo bo'lsa, bu fleansent miqdorini juda yaxshi aks ettiradi;Agar asosiy cho'qquni 80 ° C-90 C-90 ° C oralig'ida paydo bo'lsa va 80 ° C dan keyin turli xil cho'qqilar paydo bo'ladi, astar pasayadi.Uni hal qilish uchun siz yumshatish haroratini oshirishga harakat qilishingiz mumkin;agar asosiy cho'qqi 80 ° C-90 ° S oralig'ida paydo bo'lsa va harorat ko'tarilganda turli xil cho'qqilar yana paydo bo'lsa, asosan DNKning ifloslanishi bor deb hisoblanadi va tajribaning dastlabki bosqichida DNKni olib tashlash kerak.
Albatta, hali ham g'ayritabiiy vaziyatlar mavjud bo'lib, ular quyida keltiriladi.
3. Kengaytirilgan bilimlar
QPCR ni qilish uchun men miqe deyishim kerak,Minimal ma'lumotnashr etish uchunMiqdoriyReal vaqtda PCRTajribalar - real vaqtni miqdoriy holatga solishtirish uchun maqolalar chop etish uchun minimal ma'lumoteksperimentlar.Har kimning tushunchasini soddalashtirish uchun biz asosiy tarkibni soddalashtiramiz.
Siz Internetdagi Miqe-ning asl nusxasini qidirishingiz mumkin va eng muhimi shundaki, u buni hal qiladiMaqolani nashr etishda kerak bo'lganda ma'lumotlarni tekshirish ro'yxati .
Sharhlovchilar ushbu tafsilotlarni o'qib, tajriba sifatini baholashlari mumkin;Kelajakdagi o'quvchilar bundan tajribani takrorlash yoki yaxshilash uchun ham foydalanishlari mumkin.
Shuni ta'kidlash kerakki, ushbu ro'yxatda har bir ro'yxatning ahamiyati mos ravishda E yoki D bilan belgilanadi.Bu nima degani?E: Asosiy ma'lumot (topshirilishi kerak);D: istalgan ma'lumot (iloji boricha ta'minlang).
Miqe (1) - - -Eperimental dizayni
Aspiranturada o‘qishni tugatgandan so‘ng himoyasini tugatgan ko‘plab nopoklar mustaqil ravishda eksperiment tuzishni, daftarlarini ochishni va o‘qituvchining aytganini bajarishni bilmaydi.Natijada, eksperimental dizayn qat'iy emas edi va jurnal tahririyati ular bu rasmni va u rasmni yaratishni xohlashlarini aytdilar, shuning uchun ular buni hayratda qoldirdilar.Sparkmalar shunday qilingan!
Uyga yaqinroq, tajribaning birinchi printsipi aniqlanishi kerakeksperimental mantiqning qat'iyligi.Eng asosiy narsa eksperimental loyihadir va eksperimental dizayndagi eng muhim narsa maqsadli namunani, mos yozuvlar namunasini (nazorat) va takrorlashlar sonini qanday belgilashdir, shuning uchun eksperimental ma'lumotlarga havola qilish, taqqoslash va ishonchli bo'lishi mumkin.
Maqsad namunasiMuayyan davolanishdan keyin maqsadli genni aniqlashimizni talab qiladigan namunani anglatadi.Ma'lumot namunasinamuna hech qanday davolanmasdan, bu biologiyadagi yovvoyi tip deb ataladi.
Eksperimental rekeratsiyalarjuda muhim.Odatda, ishonarli takrorlashlar soni uchtadan ko'p bo'lishi kerak.Biologik replikatsiya nima ekanligini va texnik replikatsiya nima ekanligini farqlash kerak.
Biologik o'qiyalar: Turli materiallar (vaqt, o'simliklar, partiyalar, reaksiya plitalari) bilan amalga oshirilgan bir xil tekshirish tajribasi.
Biologik takrorlanish
Misol tariqasida qalampirni pestitsid bilan davolashni olaylik.Biz ABCning uchta o'simlikida pestitsidlarni püskürtallamoqchimiz, shunda ABCning uchta o'simliklari uchta biologik ishlov berishadi va ular turli xil materiallar bilan amalga oshiriladi.Ammo tajriba sifatida, nazorat, albatta, A zavodining eksperimental guruhini shakllantirish uchun bir o'simlikning filiallaridan birini püskürtünü, boshqaruv guruhini shakllantirish uchun püskürtmek.B va C uchun ham xuddi shunday qiling.
Texnik ishlov berish (texnik takliflar): Bu operatsiyadan kelib chiqadigan xatolardan qochish uchun mo'ljallangan takroriy tajriba bo'lib, u aslida bir xil materialga kiritilgan dublikat teshikdir.Muolajalar ham, nazorat ham maqsadli gen va ichki mos yozuvlar genining replikativ sozlamalariga (kamida uchta) ega bo'lishi kerak.
Texnik takrorlash
Yana bir misol sifatida pestitsidlar bilan ishlangan qalampirni oling.A-eksperimental zavod uchun Animent gen va ichki ma'lumot geni uchun uchta PCR teshiklarini va 3 ta ichki hujjatlar uchun uchta PCR teshiklarini, shunda aniqlashdan keyin o'rtacha.Zavodni boshqarish uchun guruhlar ham xuddi shunday munosabatda bo'lishadi.Xuddi shunday, B va C zavodlari uchun xuddi shunday davolanish.Bu texnik takrorlash.
Shuni ta'kidlash kerakStatistikaga kiradigan narsa bu biologik takrorlash, texnik takrorlash esa tajriba jarayonida tasodifiy hodisalar bor yoki yo‘qligini tekshirish, bu bilan tajriba natijalari ishonchli bo‘lishi, ya’ni biz tez-tez aytganimizdek ularning o‘rtacha qiymatini olib, xatolarga yo‘l qo‘ymaslikdir.
Salbiy boshqaruv - NTC va NRT
NTC (no-shablonni boshqarish), shablonsiz nazorat eksperimental materialning ifloslanganligini tekshirish uchun ishlatiladi.Odatda, suv shablon sifatida ishlatiladi.Agar lyuminestsent reaktsiya bo'lsa, bu laboratoriyada nuklein kislota bilan ifloslanish sodir bo'lganligini ko'rsatadi.
Bu ifloslanishlar quyidagilardan kelib chiqadi: nopok suv, endogen DNKni o'z ichiga olgan malakasiz reagentlar, primer ifloslanishi, laboratoriya jihozlarining ifloslanishi, aerozol ifloslanishi va boshqalar, RNase tozalash vositalarini va RNase inhibitörlerini ishlatish kerak.Aerozolning ifloslanishi - bu eng qiyin.O'zingizning laboratoriya sizning smog kabi ekanligingizni tasavvur qiling, havoga har xil nuklein kislotalar bilan.
NRT (yo'q, teskari transkripsiyasiz boshqaruv salbiy nazorat sifatida teskari bo'lmagan transkripsiyalangan RNK bo'lib, u gDNK qoldig'ini nazorat qiladi.
Genni ifodalashda RNK miqdori teskari transkripsiyadan keyin cDNK miqdorini aniqlash orqali aniqlanadi.Agar RNN poklanganida GDNA qoldiq bo'lsa, u eksperimental natijalarga olib keladi, chunki olingan natijalar GDNA va CDNA.RNKni ajratib olish jarayonida faqat cDNK emas, balki umumiy darajada gDNK butunlay olib tashlanishi kerak.
Miqe (2) - boshqa ma'lumotlar
Ushbu namunaviy ma'lumotlar shuni anglatadiki, QQC haqida maqola nashr etsak, biz maqolaning ajralmas qismi bo'lgan namunaviy ma'lumotni tushuntirishimiz kerak.Shunga o'xshab, biz namunalarni qayta ishlashda, namunalarning haqiqiyligini ta'minlash uchun o'z operatsiyalarimizni tartibga solishimiz kerak.
Namuna tavsifi faqat natijadir va biz butun tajriba davomida olingan materiallarga ko'proq e'tibor qaratishimiz kerak.
Eksperimental materiallarni tanlash
Qon namunalari - yangi qonni, 4 soatdan ko'p bo'lmagan yangi qonni tanlang.Uyali namunalar - kuchli o'sish davrida yangi hujayralarni to'plashni tanlang.Hayvonlarning to'qimalari - yangi, baquvvat to'qimalarni tanlang.O'simlik to'qimasi - yangi, yosh to'qimalarni tanlang.
Ushbu bir nechta jumlalarda kalit so'z borligini payqadingiz: yangi.
Yuqoridagi namunalar uchun bozorda eng yaxshi, iqtisodiy jihatdan samarali va barqaror to'plamlar - bu DNK va RNKni tez va osongina oliblashi mumkin bo'lgan yuqori va barqaror to'plamlar uchun.
Hujayra umumiy RNK izolyatsiyasi to'plami
Hayvonlarning umumiy RNK izolyatsiyasi to'plami
O'simlik umumiy rna izolyatsiyasi to'plamlari
O'simlik umumiy rNA izolyatsiyasi to'plam
Eksperimental materiallarni saqlash
Umuman olganda, agar shartlar ruxsat bersa, biz namunalarni saqlashni tavsiya qilmaymiz.Biroq, tanlab olishdan so'ng darhol tajriba o'tkaza olmaydigan ko'plab do'stlar ko'p va hatto suyuq azot tanklarini namuna olish uchun maydonga olib borishi kerak.
Bunday qattiq ishlaydigan do'stingiz uchun men faqat regent sarflanadigan materiallarni tushunmaysiz deb aytishingiz mumkin.Endi ko'plab regent iste'mol kompaniyalari RMGUL namunalarini xona haroratida saqlaydigan reagentlarni ishlab chiqaradi va siz ulardan foydalanishni tanlashingiz mumkin.An'anaviy saqlash usuli suyuq azotni saqlashdir, bu ozgina suyuq azot idishi yordamida olib yurish oson.Namunani laboratoriyaga olib kelgandan so'ng, uni -80 ° C muzlatgichda saqlang.
RNN ishtirokchi bo'lgan tajribalar uchun oltita so'zli tamoyilga amal qilish kerak:past harorat, fermentlar yo'q,vatez .
Kam harorat tushunchasi tushunish oson;Fermentlarsiz, biz dunyoning hamma joyida yashaymiz (aks holda siz OIV tomonidan o'ldirilgan bo'lar edingiz), shuning uchun tajribalarni bajarish juda muhim tushunchadir;tez,Dunyoda hech qanday o'pish yo'q, uni sindirib bo'lmaydi, faqat tezlikni buzib bo'lmaydi.
Shuning uchun, ajratib olish vaqtini qisqartirgan holda, tanaffusning qisqa vaqt ichida.Nima uchunForegene'Kit tezlikni ta'kidlaydi, chunki ular buni yaxshi biladilar.
PS: Ba'zi qizlar juda ehtiyotkorlik bilan tajriba qilishadi, ammo bir necha yillik ishlardan keyin ular slam dunk kabi yaxshi emas.Ular Xudo adolatsiz deb o'ylashadi, boshqalarga shikoyat qiladi va hayotni qidiradi.Aslida, u buni tushunmadi.U RNKni yaxshi himoya qilmadi va Slem Dunk o'yinchisi nimi edi.U tajribani amalga oshirganida, u Slamchani uch marotaba, besh marta va ikkita bo'linma bilan tugaydi, deb o'yladi, lekin u tajriba qildi.
Eslatma: Sekinroq, RNAZ bosqinchilari.Qanday qilib o'zingizni ro'za tutishga o'rgatasiz?Hech qanday yo'l yo'q, shunchaki ko'proq mashq qiling.
Turli xil tajribalar va turli xil namunalar uchun ko'proq adabiyotlarni o'qish va qayta ishlash uchun tegishli usulni tanlash kerak.Namunaviy yig'ish va saqlash jarayonida mike qog'ozda aniq yozilishi kerak, shunda sharhlovchilar qog'ozning ishonchliligini ko'rib chiqishi va tajribangizni takrorlash uchun hayratlanarli yoshlar uchun juda qulaydir.
Biologik tajribalar qiyin bo'lsa-da, ular yuqori.Agar ehtiyot bo'lmasangiz, dunyoni mag'lub qilishingiz mumkin.Masalan, SARSlarni biokimyoviy inqirozga aylantirish yoki 1,3 milliard kishini tejash uchun gibrid guruch qilish.Quyidagi rasm kimyoviy eksperiment bo'lib, siz uning xayolparast ko'rinishi bilan shunchaki izlanishingiz qanchalik mag'rurligingizni tushunishingiz kerak.Uni unuting, qora qilmang.
Miqe (3) - kislotadan yadro tortishish.
Nuklein kislotasi olish katta voqea va barcha molekulyar biologiya bo'yicha tajribalar nuklein kislotasi ekranidan boshlanadi.Avvalo, keling, mike-ning tarkibini nuklein kislotasi olish uchun nusxalashimiz mumkin.
Ushbu shaklga qarab, siz sirtda qololmaysiz.Shakl dogma.Eng yaxshi talaba bo'lish uchun, nima uchun so'rashingiz kerak.Ushbu jadvalning muhim mazmuni:tozalik, yaxlitlik, mustahkamlik va qisqartirish miqdori .
Birinchi qismiJarayon yoki asbob - bu yadro kislotasi qazib olish bosqichi.Agar siz ekstrakti uchun avtomatik nuklon kislotasi ekstraktoridan foydalansangiz (Kengaytirilgan, iltimos, sotib olish uchun men bilan bog'laning), siz asbobning model nomini ko'rsatishingiz kerak.
To'plam nomi va
Ma'lumotlar tafsilotlari uchun qanday to'plam ishlatilgan, qaysi maxsus reaktorlar qo'shilgan yoki boshqalar sizning tajribangizni osongina takrorlashlari uchun aniq tushuntirish kerak.
Ba'zi odamlar maxsus namunalarni olishda maxsus regenentlarni qo'shib, bu ularning yashirin qurolidir va boshqalarga aytmaydilar.Unda sir saqlanib qolganda, ular sizning maqolaingizni porlash imkoniyatini yo'qotadilar.Aqlli bo'lmang, agar siz aqlli bo'lishni istasangiz, qadimgi Jangdan ko'ra rostgo'y bo'lishingiz kerak, maqola sizni ahmoq qiladi.
Kit mahsulotlarining sonini eslab qolishingiz kerakKitga buyurtma berganingizda va maqolani yozing.Umuman ikkita raqam bor: CAT-katalog raqami (mahsulot raqami, maqola raqami), Lot-mahsulot raqami (qaysi partiyadan olingan mahsulot paydo bo'lishi uchun ishlatiladi).
Bundan tashqari, CAS raqami ko'pincha biokimyoviy reaktivlarni buyurtma qilishda ishlatiladi va men uni birgalikda tarqataman.CASS raqami Amerika kimyoviy jamiyati tomonidan har bir yangi kimyoviy dori-darmonga berilgan raqam.Umuman olganda, uchta raqam tire bilan bog'langan.Rushui-ning CS raqami: 7732-18-5.Kimyoviy moddalar ko'pincha bir nechta taxalluslarga ega, ammo CASS raqami noyobdir.Dori-darmonlarni buyurtma qilganda, avval uning CAS raqamini tekshirishingiz mumkin.
Uyga yaqinroq, nega biz bularni aniq tasvirlashimiz kerak?Aslida, bu RNK ekstraktsiyasining sifatini tekshirishdir.Asboblar va to'plamlardan foydalanish RNNni ajratish yanada izchil qiladi.Oddiy laboratoriyalarning qazib olish hajmi katta emas va uni forma bilan olish mumkin.
DNAZ yoki RENAZ davolash tafsilotlari
Flenensent miqdorining muhim masalasi DNKning ifloslanishining oldini olish va ifloslanish bo'lsa, tajriba o'tkazmang.Shuning uchun, siz DNKni ishlov berish uchun foydalangan jarayonni eksperimental jarayon to'liq olib tashlanganligini namoyish qilish uchun sizdan foydalangan jarayonni aytib berish juda muhimdir.sxematik diagramma bilan ifodalanadi.
RNN va DNKning sxematik diagrammasi
Umuman olganda, DNKni olib tashlash usuli, qazib olingandan keyin DSPAZ bilan RNKni davolashdir.Biroq, bu nisbatan eski usullar.Tijorat RNNni olish ko'chasi, qazib olish jarayoni davomida DNKni dnase qo'shmasdan chiqarib yuborishga muvaffaq bo'ldi.Masalan, afsonalardan bir qator to'plam.
Eslatma: RNNni olish paytida DNKni olib tashlash juda xavfli ikki qirrali qilichdir, ular RNNni olish vaqtini uzaytiradi va RNKning buzilishi xavfini oshiradi.Asosan, bu RNK rusumli va tozaligi o'rtasidagi savdo-sotiq.
Bundan tashqari, kremniy asosidagi reklama ustuniga qo'shilgan dnase miqdori juda kichik va effektga erishish uchun yuqori sifatli dpaniyadan foydalanish kerak.Noto'g'ri DSAZ tez va to'liq hazm qilinmaydi.Bu savdogarning texnik darajasining sinovidir.Albatta, bu DNKning maqtanishini DNA-da yo'q qilish mumkin bo'lgan yanada g'alati savdogarlar ham bor.Aytish mumkinki, DNKni zinapoyaga olib tashlagan har kimni dnazesiz olib tashlash mumkin.DNK nisbatan barqaror barqaror barqaror tuzilishdir va uni masxara qilish va kulish orqali yo'q qilinmaydi.
Kontaminatsiya baholash
Baholash usuli: elektroforezni aniqlash, 1% atar, 6v / sm, 15min, 1-3 ul gacha yuklanmoqda
Nuklein kislotasi miqdorini aniqlash
odatda uv spektrofotometr yordamida o'lchanadi.MD260, OD280 va OD230 ning uchta qiymatining ma'nosini birinchi bo'lib ommalashtirishga ijozat bergaysiz.
· Od260nm: bu nuklein kislotasining eng yuqori singillari cho'qqisining davri va eng yaxshi o'lchangan qiymat 0,1 dan 1,0 gacha.Agar yo'q bo'lsa, namunani diapazonga keltirish uchun suyultiring yoki konsentratsiyalang.
·OD280nm: Bu oqsil va fenolik moddalarning eng yuqori yutilish cho'qqisining yutilish to'lqin uzunligi.
OdD230nm: Bu uglevodlarning eng yuqori singillari cho'qqisining davri.
Keyingi, keling, har bir ko'rsatkichning roli haqida gapiraylik.A260 uchun uni nuklein kislotasining hosilini o'lchash uchun ishlatilishi mumkin.Od260 = 1, DSDNA = 50 MKG / ML, SSDNA = 37 ml, RNA = 40kg / ml.
Tozani biz kuzatib boramiz: Od260 / 280 va OD260 / 230.
Toza DNK: OD260 / 280 1,8 ga teng.1,9 dan katta bo'lganida, RNN ifloslanishi borligini va u 1.6 dan kam bo'lganda, protein va fenol ifloslanishini anglatadi.
Reme Rna: 1.7
Od260 / 230: Bu DNK yoki RNN, ma'lumot qiymati 2.5.2.0 dan kam bo'lsa, bu shakar, tuz va organik moddalarning ifloslanishi mavjudligini ko'rsatadi.
RNNning yaxlitligi
RNNning yaxlitligini o'lchash juda muhimdir.Umuman olganda, RNK Denaturatsiyasini 28 yoshdan 18 va 18s RNN o'rtasidagi yorqin munosabatlar ikki baravar o'zgarganligini tekshirish kerak.Uchinchi guruh paydo bo'lganda, RNK mutlavertmasidan tashqari, deflatsiya qilishni boshlaganini anglatadi.
RNK Sifatni baholash to'g'risidagi ma'lumotlar: yuqoridagi testlarga qo'shimcha ravishda RQning avtomatik elektroforeze tizimining ilmiy-yaxlitlik testida, masalan, RQ uchun avtomatik elektroforeze tizimini tasavvur qilib bo'lmaydi.
Ilmiy tadqiqotlarda floresan miqdoriy PCR maqsadli gen va ichki mos yozuvlar geni o'rtasidagi taqqoslashdir.Shuning uchun RNK namunaviy saqlanishini, RNNni olish va boshqalar jarayonida, asosiy maqsadi RNKning yaxlitligini ta'minlash.
RRN ning yaxlitligi maqsadli gen va ichki ma'lumot gen orasidagi muvozanatni quyidagi rasmdan osongina tushunish mumkinligini qanday ta'sir qiladi.Eski tanazzul, ichki ma'lumot genining yoki maqsadli genning to'liqligi to'liq emasligidan yoki maqsadli genning to'liq emasligi, ma'lumotlarga katta ta'sir ko'rsatadimi yoki yo'qmi, general-tanaffrlikni boshlaydi.
Maqsadli gen va havola genining sxematik diagrammasi to'g'ri bo'lmasligi kerak
Inhibitsion test (yuqori yoki past kontsentratsiya ostida yoki boshqa shartlarda yoki boshqa shartlarda)
Ushbu ko'rsatkichni misol sifatida olib, besh egri chiziqlar quyidagicha.KT qiymatlarini egri chiziqlar bilan taqsimlash notekis bo'lib, KT qiymatlari yuqori va past konsentratsiyalar ostida kechiktiriladi, bu PCR insillashi hisoblanadi.
Asosiy nuqta: RNNni olish jarayonida noto'g'ri tushunchalarni tark etishimiz va to'g'rilarni yaratishimiz kerak.
Noto'g'ri g'oya: RNNni olish faqat hosilning katta miqdorini oshiradi, deb o'ylaydi, bu yuqori darajadagi.Darhaqiqat, biz miqdoriy aniqlashni amalga oshirganimizda, agar genlar soni unchalik katta bo'lmasa, bizga ko'p RNK kerak emas.Siz ekstraktingiz miqdorini etarlicha ko'proq.
To'g'ri tushuncha:RNNni olish tozalik, yaxlitlik va izchillikni izhor qilishi kerak.Tozalash keyingi teskari tranzaklanishni to'xtatmasligini va ma'lumotlar DNK ta'sir ko'rsatmasligini ta'minlaydi.Benuqsonlik maqsadli ketma-ketlik va ichki ma'lumotnomalar balansini ta'minlaydi.Barqaror namunaning barqaror yuklashni ta'minlaydi.
Mike (4) - teskari transkripsiya
Noto'g'ri tushuncha: yuqori namunaviy hajmga intilish.
To'g'ri tushuncha: RNK yuklangan miqdoridan qat'i nazar, izchil tranzitlanish samaradorligini oshirish, tranzitlanish samaradorligi sentnadagi farqlarni chindan ham MRNAda keltirib chiqarishi mumkinligini ta'minlaydi.
Biz bu jarayonni sxematik diagramma bilan tushuntiramiz:
Teskari tranzitlanish samaradorligini sxematik diagramma, to'g'ri bo'lmang
Birinchidan, biz teskari transkripsiya jarayoni va PCR jarayoni o'rtasidagi farqni tushunishimiz kerak.PCR bir nechta isitish va yumshatish jarayonlarini boshdan kechiradi va maqsadli parchani eksponentga aylantiradi;Teskari tranzitlanish bunday jarayon bo'lmasa-da, teskari transkript replikatsiya jarayonida bir-biriga mos keladi, deb o'ylashimiz mumkin.
CDNA ma'lumotlari paydo bo'lishi mumkin bo'lganligi sababli, hozirda tushunish kerak, chunki katta va kichik bir tomonlar tiklanmoqda va bitta pardaga e'tibor berishning iloji yo'q.Va RRN ning miqdori juda kichik bo'lsa, olingan CDKning miqdori, shuningdek, PCRdan farqli o'laroq, pcce dan farqli o'laroq, u aniqlanish effekti mavjud.
CDNALeleleleleSis natijalari
Ikkinchidan, ideal holda, teskari transkripsiya bir-biriga to'g'ri keladi, ammo har qanday kompaniyadan hech qanday teskari trandentatsiya amalga oshirilmaydi.Asosan, teskari tintuvlar samaradorligi 30-50% gacha bo'lib qoladi.Agar shunday bo'lsa, biz nisbatan barqaror transkripsiya samaradorligimizni istaymiz, bu rasmda: 3 RNAS 2 CDNAS, 6 RNAS 4 CDNAS, shunchalik o'zgaruvchan, teskari transkripsiya samaradorligi nisbatan barqaror.Biz teskari transkripsiya samaradorligi beqaror va yuqori konsentratsiyani inhibe qilgan vaziyatni ko'rishni xohlamaymiz.
Xo'sh, teskari transkripsiya samaradorligi barqaror yoki yo'qligini qanday tekshirish mumkin?Usul juda sodda, siz faqat taqqoslash testini o'tkazishingiz kerak: biri RNN-ga transkursiya qilish kerak.Eng yaxshi talaba sifatida siz buni soniyalarda tushunishingiz kerak.Quyida ko'rsatilganidek:
Teskari tranzitorlik samaradorligi barqarorligini tekshirish uchun RNN va CDNAning suyulishi
Teskari t. Va to'plam
Qanday qilib mukammal floresan miqdoretik PCR a'lo teskari tazyiqli va to'plam mavjud.Teskari trandzaza manbaning, AMV yokiM-mlvVa ularning chiqishlari jadvalda ko'rsatilganidek bir xil.
RNAZE H FAOLIYAT
RNAZH H - Xitoy nomi DNK-RNNNNNA gibrid zanjirida, gidrolyze RNNA-dagi entariblerible-irmoqning RaconkeNe-Raconukzenz.RNAZO H Yagona va ikki bo'lakli DNK yoki RNKdagi fosxodion aloqalarining gelzeni, ya'ni u bitta stankalangan yoki ikki struktelli DNK yoki RNKni hazm qilish mumkin emas.CDNE ikkinchi ipning sintezida keng tarqalgan.
Bu g'alati narsa.Biz teskari tintuv o'tkaziladigan trandentlasning RNAZAS ni o'z ichiga olganligini aytamiz, chunki teskari txtetrni o'z ichiga olgan holda, ehtimol, teskari txtetrdan ajratib bo'lmaydigan bo'lishi mumkin emas, ehtimol ushbu faoliyatni teskari trandentatsiyadan o'zgartirish mumkin.
Shuning uchun, AMV ning yuqori teskari transkripsiya samaradorligidan qat'i nazar, uning RSARzi CDN ning hosildorligini kamaytiradi.Albatta, reagent ishlab chiqaruvchilari o'zlarining mahsulotlarini doimiy ravishda CDNAning hosilini oshirish uchun imkon qadar raqobatlashadilar.
Yumshatish harorati
Turli haroratlarda RNKning ikkilamchi tuzilishi
Turli haroratda RNKning ikkinchi darajali tarkibi uchun yuqoridagi rasmga qarang va ma'lum bir harorat va tuz konsentratsiyasining ikkilamchi tuzilishini aniqlash uchun Mern Onlayn vositasidan foydalaning.55 ° C da RRN ning ikkilamchi tuzilishi hali ham murakkab, teskari tazyiqlar ishlay olmaydi, ammo ikkinchi darajali tuzilma 65 ° C gacha, AMV va M-Mlv ushbu haroratdan ancha past bo'lmaydi.
nima qilsa bo'ladi?Ikkilamchi tarkib - shablonning o'zi - ilg'or va teskari tranzon va shablon o'rtasidagi kuchli raqobatga olib keladigan, natijada past e va yomon takrorlanishi kabi bir qator muammolarga olib keladigan bir qator muammolarga olib keladi.
nima qilsa bo'ladi?Faqat avvalgi haroratni iloji boricha oshiring.
Ko'pgina reagent ishlab chiqaruvchilari genetik muhandislik orqali o'zlarining teskari transkriptazalarini yaxshilaydilar.Ba'zilar, Jilan va Aseay kabi reaktsiya haroratini oshiradi, ba'zilari esa fermentning fermenti va RNA shablonlari o'rtasidagi yaqinlikni yaxshilash uchun RNAZE H Fermeningni olib tashlaydi.Yuqori yaqinlik ikkilamchi tuzilishni siqib chiqarishi va muammosiz o'qiydi va o'zgaruvchan transkripsiya samaradorligini oshirishi mumkin.
Kalit nuqtai nazar: teskari transkripsiya natijalarini amalga oshirish uchun teskari tranzitura (fermentlar nafaqat unumdor, balki barqaror bo'lishi, balki barqaror bo'lishi, balki barqaror bo'lishi kerak), agar u juda keng miqyosli lichinkachiligi miqdorini emas, balki umuman mumkin emas.Bir nechta CDNAS.
Turli ishlab chiqaruvchilar ham izchillikka intilishda ba'zi sa'y-harakatlarni amalga oshirdilar.Masalan, endi aksariyat kompaniyalar teskari tranzitorni sotish uchun standart to'plam sifatida qadoqlashdi, bu yaxshi tanlovdir.
Masalan, Oldingi seriyali seriya to'plamlari:
RT Easy I (birinchi zanjirli cDNK sintezi uchun asosiy premiks)
Mike (5) - maqsadli gen ma'lumotlari
Yuqoridagi raqam tushuntiradi
1. Bu genni takroriy eksperimentlar, odatda takroriy tajribalar tomonidan tasdiqlanishi mumkinmi.
2. Gen ID, bilasiz.
3. Gen uzunligi, maqsadli genning umumiy uzunligi, albatta, muammo emas.Primerlarni loyihalashda kuchaytirish samaradorligini oshirish uchun amplikon uzunligi 80-200bp orasida bo'lishini ta'minlang.
4. Sequence Blast taqqoslash ma'lumotlari, maqsadli genni o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirilishining oldini olish uchun genbankda solishtirish kerak.
5. Psevodogenlar mavjudligi.Psudogen - bu oddiy genga o'xshash dna ketma-ketligi, ammo normal funktsiyasini yo'qotadi.Ko'pincha u eukaryotlarning ko'p gene oilasida mavjud.Odatda ψ tasvirlanadi.Bu genomdagi funktsional bo'lmagan Genomik DNK nusxasi, bu genning ketma-ketligiga juda o'xshash., odatda, birlashtirilmagan va aniq fiziologik ma'noga ega emas.
6. Exon va intonsiyalarga nisbatan primentlarning holati.Dastlabki yillarda, DNK ifloslanishini hal qilganimizda, biz DNK kuchaytirishidan qochish uchun asosan delkerlar, exonlar va intons pozitsiyalariga e'tibor qaratamiz va odatda DNKni kuchaytirishdan saqlaning.Iltimos, quyidagi rasmga qarang: Qora intons, turli blyuzlar exkondlar, pushti keng tarqalgan astarni ifodalaydi va yorqin qizil.
Sxematik, hech qachon haqiqat
Bu juda yaxshi rejani uyg'otadi, lekin aslida, introponstron astarlari xayoliy emas va ular aniq bo'lmagan kuchaytirishga olib keladi.Shunday qilib, DNK ifloslanishining oldini olishning eng yaxshi usuli bu DNKni to'liq olib tashlashdir.
7. Tuzilishni bashorat qilish.Ushbu misoldan foydalanib, ma'lum bir harorat va tuz konsentratsiyasida maqsadli bo'laklarning ikkinchi darajali tuzilishini aniqlash uchun m werne onlayn vositasidan foydalaning.
Turli haroratlarda RNKning ikkilamchi tuzilishi
Ikkilamchi tuzilma - shablonning o'zi, armit va shablon juftligi o'rtasidagi kuchli raqobatga olib keladigan va primerlarni majburiy raqobat kamroq, masalan, past e va yomon takrorlanishi kabi bir qator muammolar paydo bo'ladi.Dasturiy ta'minotni bashorat qilish orqali, agar ikkilamchi tuzilish muammosi bo'lmasa, bu juda yaxshi bo'lar edi.Agar mavjud bo'lsa, bizning keyingi maqolamizda ushbu muammoni qanday hal qilish kerak.
Muqe (6) -qcr eigonukitidlari
Fluensent miqdorini buzish uchun PCR har kuni kurashasiz, bu RNNni olish. Ikkinchi narsa - bu primer dizayni bo'lishi mumkin.
Birinchidan, biz hali ham Miqe nazorat ro'yxati bo'yicha progri dizayni haqidagi qoidalarni tekshiramiz.Scumbs kulishi juda oson, va biz uni bitta jumlada tugatishimiz mumkin: primer tekshiruvi va modifikatsiya usulini aniqlashimiz mumkin.Ilovani tozalash usuli, hozirgi paytda qoshiq sintez juda arzon, QPRC Sahifa va undan yuqori tozalanish usullari va sintez vositasi ma'lumotlari muhim emas.Ko'p odamlar o'nlab yillar davomida birinchi o'nlab yillar davomida boshlanmoqda va sintezer ABI3900 ekanligini bilishmaydi.
Arster dizayni tamoyillari to'g'risida siz ularni rote qilishingiz shart emas, chunki agar siz birma-bir o'qiyotgan bo'lsa, bu muammolarni qo'lda ko'rib chiqa olmaydi, agar siz birma-bir o'qiyotgan bo'lsangiz, u xoch ko'zni ochadi.
PRIMEKTLARNI BIRINChI KO'RSATIShDAN OLDIN:
1. 3-yilga yaqin bo'lgan birinchi navbatda: Oligo DTRAPRAND Symentlari va RNK yaxlitligini ko'rib chiqishda, ishlab chiqarilgan astarni kuchaytirish uchun mo'ljallangan 3-bosqichga yaqinlashishi kerak.Quyidagicha tushuntirish uchun rasmdan foydalaning (buni tushunishning iloji yo'q):
Nima uchun 3-yilga yaqin joyda ishlab chiqilishi kerak, bu haqiqat bo'lmasligi kerak
2. TM qiymati: TM qiymati 55-65 ° C gacha (60 ° C da eng yuqori) va GC tarkibi 40% -60% ni tashkil qiladi.
3. Blastmasin: Genomning o'ziga xos kuchaytirmasligi uchun portlash qo'shimcha tekshirish uchun ishlatilishi kerak.
Mike (7) -qcr jarayoni
1. QPCR to'plam
Mike talablariga ko'ra, biz maqolada to'liq reaktsiya shartlarini aniq tasvirlashimiz kerak, bu erda qanday to'plam, statsion usuli yoki prob turi qanchalik katta bo'lsa, PCR dasturi sozlamalari.Faxriy haydovchilari, albatta, to'plam tanlangan bo'lsa, yuqoridagi ma'lumotlar asosan aniqlanadi.
Hozirgi vaqtda flumesan miqdorini ishlab chiqarish va ishlab chiqarish PCR to'plamlari juda etuk texnologiyas.Agar siz juda yomon ishlab chiqaruvchilarni tanlamasangiz, muammolarning ehtimoli katta emas, ammo biz hali ham siz bilan bir nechta fikr bilan baham ko'rishni xohlaymiz:
Issiq start:PCRning eng muhim qismi - bu issiq starta ferment.Umuman olganda, bozorda issiq boshlanadigan fermentlar - bu ikki turga bo'linadi.Kimyoviy modifikatsiya - bu issiq boshlang'ich fermentlarning erta usulidir.Muayyan haroratga erishilganda ferment o'z faoliyatini chiqaradi.Antibos-o'zgartirilgan issiq starta fermenti ferment faoliyatini blokirovka qilish uchun biologik usullardan foydalanadi.Muayyan haroratga erishilganda, antibod hisobga olinadi va protein sifatida faollashtiriladi va ferment faolligi bilan shug'ullanadi.
Biroq, bu qanday foydalanish kerak?Ish shuni ko'rsatadiki, antiboslashtirilgan fermentlarning chiqarilishi kimyoviy o'zgartirilgan fermentlarning faolligi, shuning uchun sezgir fermentlar, antikodiy fermentlar, shuningdek, bozordagi to'plamlarda kimyoviy o'zgartirilgan fermentlar mavjud.Agar mavjud bo'lsa, ushbu ishlab chiqaruvchining texnologiyasi hali ham ming yillik davrida qolmoqda.
Magniy ion konsentratsiyasi:Magniy ion konsentratsiyasi PCR reaktsiyasida juda muhimdir.Kerakli magniy ion kontsentratsiyasi TAQ ferment faolligini chiqarishni targ'ib qilishi mumkin.Agar kontsentratsiya juda past bo'lsa, ferment faolligi sezilarli darajada kamayadi;Agar kontsentratsiya juda yuqori bo'lsa, ferment-katalizedilmagan kengaytirish kuchaytiriladi.Magniy ionlarining kontsentratsiyasi andozalar va PCR mahsulotlarining eritadigan harorati, shablon va PCR mahsulotlarining eritilishi haroratiga ta'sir qiladi va shu bilan kuchaytirilgan parchalarning hosildorligiga ta'sir qiladi.Magniy ionlarining kontsentratsiyasi odatda 25 mm da boshqariladi.Albatta, yaxshi to'plam uchun magniy ionlarining kontsentratsiyasi yaxshi nazorat qilinishi kerak.Ba'zi savdogarlar magniy ion konsentratsiyasini avtomatik sozlash ta'siriga erishish uchun magniyga magniyga qo'shilishadi.
Floreansent bo'yoq kontsentratsiyasi:Odatda, derali derali derani bog'lab turadigan derani birlashtirganligi sababli, asosan, ikki bardoshli DNKning birlashtirilgan, shuning uchun derani ikki mardikor derali rangga aylantiradigan, asosan, derani ikki mardikor derali rangga aylantirganligi sababli, asosan, ikki bardoshli DNKning birlashtirilishi mumkin.
PS: Yorug'lik xususiyatlari tufayli bozordagi mahsulotlar odatda jigarrang shaffuchli san'a san'ati naychalariga qadoqlangan (quyidagi rasmda ko'rsatilganidek).Biroq, bu muammoga duch keladi.Suyuqlikni namunaganda so'rib olish qiyinligini ko'rish qiyin.Shu munosabat bilan, albatta, haqiqatan ham eng qulay (quyidagi rasmda ko'rsatilganidek) va shaffof naychada qadoqlangan.Keyin uni yorug'lik va tanlab olishning qulayligini hisobga olgan holda, uni qalay sumkasiga soling.Siz to'g'ri mahsulot raqamini tanlashingiz kerak.RS204 - bu juda samarali samarali mavjudot, bu meni o't o'simlik ekishni xohlaydi.
Fleaninsonent bo'yoqning kontsentratsiyasi ham juda muhimdir.Agar kontsentratsiya juda past bo'lsa, kuchaytirish egri keyingi bosqichda ko'tarilmaydi va mukammal emas;Agar kontsentratsiya juda yuqori bo'lsa, u shovqin aralashuvini keltirib chiqaradi.Florensent miqdorida PCR asosan CT qiymatiga bog'liq bo'lganligi sababli, agar floresan bo'ylning konsentratsiyasi to'g'ri o'rnatilmagan bo'lsa, past nuqta balandlikka qaraganda pastroq.Albatta, mos bo'yoq kontsentratsiyasi eng yaxshisidir.
Rohmoq: ROX bo'yoqlari yaxshi floresan signalizatsiya xatolarini tuzatish uchun ishlatiladi.Ba'zi asbob ishlab chiqaruvchilari kalibrlashni talab qiladi, boshqalari esa yo'q.Masalan, Termo Fisher Ilmiy davrida PCR statori kuchaytirish vositasi odatda kalibrlash, shu jumladan 7300, 7500, 7500, 7500, sayyora, stontepl va boshqalar uni tasvirlaydi.
Oldingi sahifalarda, shuningdek, turli modellarda foydalanish uchun qulay bo'lgan Roxli bo'yoq mavjud.
Haqiqiy vaqt PCR to'plam-Taqman
Zaif vodorod rishtalarini davolash: Zaif vodorod bog'lanishini davolash nisbatan texnik masala.Hech narsa ko'plab to'plamlarning qo'llanmasini o'qidi, ammo ularning hech biri bu mavzuni eslatib o'tmagan.Aslida, bu juda muhim.Asoslarning kombinatsiyasi asosan vodorod aloqalarining kuchiga bog'liq.Kuchli vodorodli aloqalar normal kuchaytirish, zaif vodorod zonasi aniq bo'lmagan kuchaytirishga olib keladi.Agar zaif vodorod aloqalar bartaraf etilmasa, aniq bo'lmagan kuchaytirishdan qochib bo'lmaydi.Muallif doirasida faqat bir nechta kompaniyalar bu muammoni payqashdi.Kitni sotib olganingizda, siz tanlamoqchi bo'lgan to'plam uchun bu bora bilan qaror qabul qilganingiz haqida murojaat qilishingiz mumkin.
Reaktsiya hajmi: 20-50ulyat tizimi ko'proq ishlatiladi va kamroq hajmlar xatolarga olib kelishi mumkin.Umuman olganda, KIT ko'rsatmalari PCR reaktsiya hajmidan foydalanishni tavsiya etadi.Aqlli bo'lmang va xarajatlarni tejash uchun kichik hajmlardan foydalaning.maqsadi.Savdogarlar tomonidan tavsiya etilgan hajm aslida sinovdan o'tkazildi va ehtimol ular kichik hajmlar tufayli xatolar muammosini hal qila olmaydilar.
2. Ishlab chiqaruvchi va maqola naycha plitasi
Har bir inson fledsent miqdorining printsipini biladi.Floresancalc to'plamlari asosan PCRUPA TUPAPS qopqoqlari orqali amalga oshiriladi.PCR sarf materiallarini tanlashda, ikkita nuqtaga e'tibor bering: yorug'lik uzatilishi va asbob uchun mos.Umuman olganda, asosiy yo'nalishli brendlarning taxtalari va naychalari yaxshi, ammo siz moslashuv nuqtai nazaridan diqqat bilan tanlashingiz kerak, aks holda siz asbobdan foydalana olmaysiz.
4. Yuqori darajadagi bilimlar
Miqe (8) -qcr tekshiruvi
Bu QDCRning ustuvor vazifasi!Bu erda juda ko'p qahramonlar qumga tushishdi.Albatta, siz baxtiyor ekanligingiz mumkin va siz o'rgangan genlar oddiy, shuning uchun siz shamol bo'ylab muz g'oridan suzgansiz.QQC tasdiqlash ma'lumotlari ma'lumotlarning ishonchliligini sinovdan o'tkazish uchun mo'ljallangan.Biz kerakli tekshirish ma'lumotlarini quyidagicha sanab o'tamiz:
1. Ozodlik sinovi
Taraqqali genni kuchaytirishning o'ziga xosligi elektroforez rasmi bitta guruh ekanligini tekshirish orqali sinovdan o'tkaziladi;ketma-ketlikni tekshirish;Tehrli xaritali bitta yoki yo'qligini bilish uchun egri egri;ferment hazm qilish tekshiruvi va boshqa usullar.
Bu erda biz t ga e'tibor qaratamizU egri egri usulidan foydalanib, aniq bo'lmagan kuchaytirishni tahlil qiladi.Umuman olganda, biz birinchi navbatda, birinchi bo'lib, mahsulot parchasining o'lchami 80-200 milliard oralig'ida bo'lishi kerak.Shuning uchun, agar turli xil cho'qqilar bo'lsa, boshqa aniq bo'lmagan quvvat mahsulotlari bo'lishi kerak;Agar cho'qquni 80 ° C dan past bo'lsa, u odatda astar dimer deb hisoblanadi;Agar cho'qquni 85 ° C dan yuqori bo'lsa, u odatda dna ifloslanish yoki katta bo'laklarning haddan tashqari ko'payishi deb hisoblanadi.
Eslatma: Ba'zida 80 ° C da faqat bitta cho'qqisi bor.Bu vaqtda ushbu tushunchaga amal qilish kerak.Ehtimol, kuchaytirish natijalari barcha ustunlardir.
Oddiy eritilgan egri (yagona yuqori darajadagi kuchaytirishsiz)
Muvaffaqiyatli eritish egri (soxta cho'qqilarning o'ziga xos kuchaytirilishi)
【Kasallik tahlili】
Asosiy cho'qqisi bor, ammo astar pasayuvchi jiddiy
Quyidagi rasmdagi bitta oqqush egri egri egri chiziqni osonlikcha aldashi mumkin, ammo natija mutlaqo noto'g'ri.Bu vaqtda biz erish haroratiga qarashimiz kerak.Eng yuqori darajadagi harorat 80 ° C dan past, bu mutlaqo astarer.
Hech qanday maqsadli parchasi, barcha primer dimerlar
Bu erda akam to'xtab bo'lmaydi.Quyidagi rasm - bu menga Scumbag orqali yuborilgan mobil telefon bilan olingan fotosurat.U ishlatgan reaktivlar, barcha sohalarda keng tarqalgan brendlar.U bitta T-prefiks brendiga boshqa t-pretiks brendiga o'tdi.Menimcha, siz buni allaqachon taxmin qilgansiz.Skumma menga qichqirdi: "Birinchi rasmda ishlatiladigan reakent juda yaxshi va cho'qqisi yolg'iz.Keyinchalik, siz tavsiya qilgan reagentdan foydalangandan so'ng, u turli xil rasmga o'xshaydi.Siz meni baxtsiz qildingiz."
Ikki grafikani ajrating.Bir qarashda, bir qarashda bitta cho'qqisi bor va ikkinchisida ikki tomonlama cho'qqisi bor.Bema'nilik, bitta cho'qqi juda yaxshi.Bu haqiqatmi?
Da E dan yomonroq, agar men ikkita rasmni quyidagi rasmda joylashtirsam, darhol tushunasiz.Aslida, biz bunday rasm bilan osongina falaj qilamiz.Ehtiyotkorlik bilan tahlil qilingandan so'ng, biz buni topdik: birinchi raqamning cho'qqisi 75 ° C da, bu mutlaqo diker;Ikkinchi raqamning cho'qqisi 75 ° C va 82 ° C da paydo bo'ladi, hech bo'lmaganda mahsulot paydo bo'ladi.
Talabalarning fikr-mulohazalari rasmlari
Shunday qilib, asosiy muammo reaktivlar muammosi emas, balki primer dizayni muammosi.Shu bilan birga, ba'zi katta brendlar temir sifatidan iboratligini isbotlaydi va u avvalgidek aytganini tasdiqlaydi: bu sizning maqolani qo'llab-quvvatlaydigan reakent brendi emas.Bu sizning reagentlar markasini tuzgan maqola.Tasavvur qiling-a, agar scumgg reaktivlarni o'zgartirmasa, noto'g'ri ma'lumotlar jurnalga yuboriladi va nima sodir bo'ladi, fojia bo'ladi.
2. Bo'sh nazoratning narxi
Tushuntiring, agar bo'sh boshqaruvning CT qiymati bo'lsa, u ifloslanish emasmi?Biroq, siz hali ham qaysi bo'sh nazoratning CT qiymati borligini tushunishingiz kerak.Agar NTC bo'lsa, bu regent ifloslanish kabi xorijiy DNK mavjudligini anglatadi.Agar u NRT bo'lsa, bu tan olingan RNNning DNKning ifloslanishiga ega ekanligini anglatadi.
3. Standart egri
O'chirish va hisoblash formulasi, PCR samaradorligi formula orqali hisoblash mumkin.Ajoyib tajriba 0.9999 ga yaqinlashish uchun 3,32 ga yaqinlashish uchun standart egri chizig'ining qiyalikini talab qiladi.
4. Chirichli dinamik diapazon
Reaktsiyaning dinamik chegarasi chiziqli.Standart egri chizig'ini yaratish uchun ishlatiladigan shablon ma'lumotlariga ko'ra, dinamik diapazon kamida 5 kontsentratsiyani o'z ichiga olishi va yuqori konsentratsion gradensientlarda CT qiymatlarini o'zgartirishga e'tibor berish kerak.
5. aniqlash aniqligi
QNCR natijalari, ya'ni yomon, ya'ni yomon, ya'ni yomon, ya'ni katta omillar, shu jumladan harorat, kontsentratsiya va operatsiyani keltirib chiqaradi.QQC aniqligi odatda nusxa raqami kamayadi, chunki nusxa raqami kamayadi.Ideal holda tajriba ichidagi o'zgarishlar, ushbu texnik tafovutni biologik o'zgarishlardan ajralib turishi va biologik tarifatlar to'g'ridan-to'g'ri guruhlar yoki davolash usullari bo'yicha statistik farqlarga murojaat qilishi mumkin.Xususan, diagnostikadan tashqari, saytlar va operatorlarning eng yaxshi ichki qismini aniqlash (takrorlash) haqida xabar berish kerak.
6. Samaradorlik va lod (multiphex qpcr)
LOD - aniqlangan ijobiy namunalarning 95% ning eng past kontsentratsiyasi.Boshqacha qilib aytganda, maqsadli gen bo'yicha komplektotlar to'plamida bo'lgan qopqoqning kontsentratsiyasi muvaffaqiyatsiz reaktsiyalarning 5 foizidan oshmasligi kerak.Bir vaqtning o'zida bir vaqtning o'zida bir vaqtning o'zida mutatsiyalarni yoki polimorfizmlarni aniqlash uchun, bir nechta maqsadli bo'laklarning aniqligi, bir nechta naychani aniqlash samaradorligi va bir xil bo'lishi kerakligini isbotlashi kerak.Ayniqsa, yuqori konsentratsiya maqsadli genlar va kam konsentratsiya maqsadli genlar bir vaqtning o'zida kuchaytirilsa, bu muammoni e'tiborga olish kerak.
Muammolar va echimlarUmuman olganda, QPC-dagi QTR-diskda olib borilgan muammolar quyidagi jihatlarga bag'ishlangan muammolar:
· Norsspik kuchaytirish
Ilmiy konsentratsiyani va astarchi-nayranglar bilan muammolarni qiyin tanlash
· Yakkada yumshatish harorati noto'g'ri
Erkin tuzilishni kuchaytirish samaradorligiga ta'sir qiladi
Nonsidik kuchaytirish
aniq bo'lmagan kuchaytirishUmuman olganda, primer dizayni mos emasmi, ammo agar siz primerlarni o'zgartirishga shoshilmasangiz, avval quyidagi usullarni sinab ko'rishingiz mumkin (tamoyil ham ilova qilingan):
ENTAEDEED haroratini oshiring - zaif vodorodli aloqalar saqlanib qololmaydi;
· Qisqa muddat va uzayish vaqtini qisqartirish - zaif vodorod zonalari imkoniyatini kamaytirish;
Arster konsentratsiyasini kamaytirish - birlashtirilgan birinchi darajali va maqsadsiz mintaqalar majburiy emasligi imkoniyatini kamaytirish;
Kam quvvatlantirish samaradorligi pastligi
Qarama-qarshi vaziyatning aniq kuchaytirilishi va past kuchaytirish samaradorligi va past kuchaytirish samaradorligini oshirish choralari buning aksi:
Yakuni va uzaytirish vaqtini uzaytiring;
· Uch bosqichli PCRga o'zgartirish va yumshatish haroratini kamaytiring;
Ilmiy konsentratsiyani oshirish;
Ps: 90-yillarda tug'ilgan ko'plab aspirantlar tajriba bilan shug'ullanishni istamayman, chunki regent bo'lmagan kuchaytirish muammosini, shu jumladan, kamchilikli kuchaytirish muammosini, shu jumladan, kamchilikli exorpni joriy etishni o'z ichiga olgan. tion omillari.Muammoni osongina hal qilish uchun ahmoqlar reagent kompaniyasining joriy etilishini o'qish kerak, agar vodorodli obligatsiyalar mavjudligini biling.
Arster konsentratsiyasini qiyin tanlash va astarchi-nimlar bilan bog'liq muammolar
1-usul: Umuman olganda, QQC uchun to'plam tavsiya etilgan tizimlar va tavsiya etilgan primer konsentratsiyasini tavsiya qildi va tavsiya etilgan.
2-usul: Astar konsentratsiyasini belgilash orqali tuzatish.Quyidagi rasmda tasvirlash uchun kompaniya tomonidan o'g'irlangan.Eksperimental natijalarning KT qiymati quyidagicha rejalashtirilgan:
Astavni konsentratsiya tanlash har bir primerlarning har bir kontsentratsiyasini quyidagicha belgilang:
Arster konsentratsiyasini tanlash aniq, 100 gramm va 250nmning astarli konsentratsiyasining birinchi konsentratsiyasining chiziqli munosabatlari yaxshiroqdir va 500 km.100 sentyabr va 250nm, CT qiymati 250nm nisbatan kichik, shuning uchun optimal kontsentratsiya 250nm.Odatda kuchli astarchilarni eritilgan egrilayotganda ko'rish mumkin.Agar ishlab chiqarilgan ustunlar astarchi-nimjerlardan qochib ketolmasa nima bo'ladi?
3-usul: Ilmiy haroratni kamaytiring va yumshatadigan haroratni oshiring (tushuntirishga hojat yo'q).
Endinglash haroratining empirik qiymati 60 ° C.Agar ishonchingiz komil bo'lmasa, yana mos yumshatish haroratini qanday tanlash mumkin?Javob birinchi kontsentratsiyani tanlash bilan bir xil -Gradient testi.Muammoni tasvirlash uchun Bio-RR kompaniyasidan rasm oling.Muayyan maqsadli parchani ko'paytirish uchun har biri uchta takrorlash va olingan kuchaytirish egri chiziqlari quyidagicha:
haroratni yumshatish:
· 79 ° C - Asosan, astarlab bo'lmaydi, shuning uchun hech qanday kuchaytirilmaydi.
· 67.3 ° C - boshida oz miqdordagi kuchaytirish mavjud va KT qiymati nisbatan katta.
· 64.5 ° C - KT qiymati pasayadi.
· 60,7 ° C, 56,2 ° C, 56,2 ° C, CT qiymatlari asosan barqaror bo'lishga moyil, ammo flororecence'lonlarning yakuniy bo'lishiga moyil edi.
Qanday tanlash kerak?Printsip: Birinchi tamoyil - eng yuqori kompleks.Xuddi shu KT qiymati uchun kamayish va aniq oshirib bo'lmaydigan kuchaytirishni oldini olish uchun yuqori yumshatadigan haroratni tanlang.55 ° C da yuqori darajadagi suyuqlikning qiymati mavjud bo'lsa-da, unda xira yoki aniq bo'lmagan kuchaytirish bo'lishi mumkin.
Ammo agar siz aqlli bo'lsangiz, aniq aytasiz: Miscal gapirasiz, agar PRCRES konsentratsiyasi minimal talablardan yuqori bo'lsa, yuqori va past nuqtalar shunchaki fleninestsent bo'yoqlar va Dntps kabi ta'sir qilmasligi kerak.Darhaqiqat, so'nggi yillik harorat to'g'ri optimallashtirilsa, CT qiymatiga primer konsentratsiyasining ta'siri tabiiy ravishda minimallashtiriladi.
ENDEAERING harorati to'g'ri optimallashtiriladi va KT-dagi primer konsentratsiyasining ta'siri minimallashtiriladi
Ikkilamchi tuzilma kuchaytirish samaradorligiga ta'sir qiladi
Keling, muammoni tasvirlash uchun Bio-RRdan rasmni qabul qilaylik.Shuningdek, u ikkinchi darajali struktura bilan genni kuchaytirish uchun harorat gradientini yaratadi.
Ikkilamchi tarkib paydo bo'ladi
Ko'rinib turibdiki, harorat gradientining pasayishi, mahsulotlar paydo bo'ladi va CT qiymati kamida 60,7 ° C gacha o'zgaradi, so'ngra haroratning pasayishi kamayadi, CT qiymati kattaroq bo'ladi.Aksincha, harorat oshgan sari, ikkilamchi tuzilish ochiladi va kuchaytirish samaradorligi oshadi.Muayyan haroratga erishgandan so'ng, harorat kuchayib borishi mumkin emas.Chunki bu vaqtda birinchi navbatda birlashtirilishi mumkin emas.Shuning uchun,eng past CT qiymati bilan haroratni qidiring, ikkilamchi tuzilma shablonini kuchaytirish uchun eng yaxshi harorat!Albatta, aqlli ahmoqlar, agar kerak bo'lmasa, ustunlarni o'zgartirish va ikkilamchi tuzilish mintaqasidan qochish yaxshidir.
5. Ilova darajasi
Mike-ma'lumotlar tahlilini tahlil qilish
Ma'lumot tahlili asosan fleansent miqdorining PCR vositasi tomonidan beriladi.Oldingi maqolada, tajriba dizayniga tushuntirilgan bo'sh nazorat kabi ko'plab ma'lumotlar tahlili ishi amalga oshirildi.Ichki ma'lumot genlari, takrorlash raqamlari va boshqalar aniqlandi., Bu erda biz asosan QSR-ning dasturini tushuntiramiz.
QDCR keng qo'llaniladi va eksperimental tekshirish va nuklon kislotasi tashxisi eng ko'p ishlatiladigan stsenariylardir.
Mutlaquv miqdorini kamaytirish
Kirish (boshlang'ich kontsentratsiyasi) tsikllar soni bilan chiziqli munosabatlarga ega.Standart egri boshlang'ich nusxa raqami bilan standartdan chizilishi mumkin, ya'ni kuchaytirish reaktsiyasining chiziqli munosabatlarini olish mumkin.Namunaning CT qiymatiga ko'ra, namunadagi kontsentratsiyasi hisoblab chiqilishi mumkin.Qo'shish uchun shablon miqdori.
Mutlaq miqdor hisoblash usuli
Mutlaquv miqdori standart egri chiziqqa asoslangan bo'lishi kerak.Standart egri chizish uchun standart talab qilinadi.Odatda, standart maqsad genini klonlash orqali olingan plazma hisoblanadi.Nega bu plazmid?Chunki dumaloq plazmid DNMA eng barqaror.5 tadan 6 tagacha standart mahsulotni ikki baravar oshirish (10 baravar suyultirish) va suyulganda bir xillikka e'tibor bering.KT qiymati 15-30 orasida pasaysin.
Standart tayyorgarlik
Shu bilan birga, sinovdan o'tkaziladigan namuna shunga mos ravishda suyultirilishi kerak (suyultirish omili) va CT qiymati 15-30 orasida ham pasayishi kerak.Standart mahsulot + sinovdan o'tkazilishi kerak bo'lgan namuna avtoulovni birga joylashtiradi.Rundan keyin standart moddalar bilan standart egri chizilgan va sinovdan o'tkaziladigan namunalar kontsentratsiyani hisoblash uchun standart egri chizilgan.
Gepatit B virusi HBV miqdoriyasi - bu 1ml qonda virus nusxasini nusxalash raqamini hisoblash mumkin bo'lgan mutlaquv miqdoridir.
Nusxa raqamini hisoblash
Sinflash uchun tanlangan kontsentratsiya (NG / ul) = OD260 × 50ug / ml × qaynatish omili
Namunaviy og'irlik = bazalarning soni × 324
Sinovdan nusxa olish (nusxalari / ul) = namunadagi kontsentratsiyasi / namunadagi molekulyar og'irligi / 6 × 1014
Nusxalash raqamini hisoblash usuli
Yuqoridagilar miqdori aniqlashni hisoblash usuli hisoblanadi.Bu kichik o'rta maktabni tugatgandan so'ng, matematik muammolar odatda kompyuterlar tomonidan hal qilinganidan keyin hal qilinishi mumkin bo'lgan matematik muammo.Agar tushunmasangiz, siz aloqa qilishingiz mumkin.
Nisbiy miqdor
Nisbiy miqdorni asosan ilmiy tadqiqotlarda qo'llaniladi.1ml qonda qancha virus mavjud va bu DNK virusi, bu nisbatan aniq belgilanadi: qon miqdori aniqlanishi mumkin va DNK virusi nisbatan barqaror.Biroq, bargdagi biron bir genning transkripsiya nusxalarining sonini taqqoslash qiyin, chunki barglarning o'lchamini, og'irligini va tranzitsiyasini aniqlash qiyin, ya'ni har qanday vaziyatda xatolar paydo bo'lishi mumkin va undan foydalanish mumkin emas.
Shuning uchun nisbiy miqdorni kiritish elementni kiritishi kerak:ichki ma'lumot geni.
Boshqacha qilib aytganda, nisbiy miqdoriylashtirish aslida maqsadli gen va ichki ma'lumot gen o'rtasida taqqoslashdir.Xuddi shu to'qimalarda va bir xil hujayrada taqqoslaganda, namuna o'lchamining ta'siri, RNNni olish miqdori, teskari o'tish samaradorligi va PCR samaradorligi juda kichik.Kichik namuna hajmi tufayli ichki ma'lumotlarning ikkalasi ham, maqsadli genlar nisbatan qisqartirildi.Shuning uchun biz ilgari bir xillikni va barqarorlikni ta'kidladik.
Ichki ma'lumot genlari odatdauy bekasi genlar(uyda saqlanadigan genlar), bu barcha hujayralarda aniq ifodalangan gen sinfiga tegishli va ularning mahsulotlari hujayralarning asosiy hayotiy faoliyatini amalga oshirish uchun zarurdir.
Ushbu tushunchani chalkashtirib yubormang.Uy xo'jaligi genlari biologik funktsiyalar shartlari, ichki ma'lumotnomalar esa eksperimental texnik nuqtai nazar.Uy sharoitida genlar ichki ma'lumot genlari sifatida tanlanishidan oldin tekshiruvdan o'tishi kerak.
Masalan, turli xil to'qima hujayralarida ularning ifoda darajasini sinab ko'rish uchun quyidagi uy-joy tadbirlarini tanladik va boshqa uchta genlardan foydalanib bo'lmaydi.
Ichki ma'lumot genining tuzatish funktsiyasini tushunganingizdan so'ng, ikkita algoritmlar ichki ma'lumot genini kiritish tufayli kelib chiqadi.
· Standart egri usuli
· 2 - △△ CT usuli (CT qiymat taqqoslash usuli)
Agar siz turlarni va gen funktsiyalarini o'rganishga qiziqsangiz, iltimos, algoritmlar bo'yicha tadqiqotlardan voz keching va to'g'ridan-to'g'ri formulalardan foydalaning yoki to'g'ridan-to'g'ri mashinalardan foydalaning;Agar siz matematika va muhandislikdagi to'g'ri yigit bo'lsangiz, iltimos, o'zingizni bepul his eting.
Standart egri usuli
Nazorat namunasi va namunaviy egilgan namunani o'lchash, namunaning namunasi va namunasi standart egri chizig'i orqali sinovdan o'tkazilishi va keyin nisbiy fikr darajasi bo'lgan hisob-kitob formulasiga muvofiq nisbiy qiymatini hisoblang.
Afzalliklari: Oddiy tahlil, nisbatan oddiy tajriba optimallashtirish
Kamchilik: Har bir gen uchun tajribalarning har bir turida oddiy egri chizish kerak
Ariza: Gen-iboralarni tartibga solishni o'rganishda eng keng tarqalgan miqdordagi ikkita va aniq miqdordagi ikkitadan biri
Formula quyidagicha:
Misollar quyidagicha:
Miqdoriy natijada nisbiy miqdorni hisoblang
2 - △△ CT usuli (CT qiymati taqqoslash usuli)
Afzalliklari: standart egri chizishning hojati yo'q
Kamchiliklari: kuchaytirish samaradorligi 100% ga yaqin deb taxmin qilinadi;Standart og'ish: <5% va standart egri va har bir kuchaytirish samaradorligi izchil bo'lishi mumkin deb taxmin qilinadi;Eksperimental sharoitlarni optimallashtirish murakkabroq.
Ariza: Gen-iboralarni tartibga solishni o'rganishda eng keng tarqalgan miqdordagi ikkita va aniq miqdordagi ikkitadan biri
Albatta, kuchaytirish samaradorligi odatda to'g'ri bo'lishi mumkin emas. Agar biz maqsadli gen va ma'lumotlarning samaradorligi bir xil darajada tuzatilsa, masalan, kuchaytirishning samaradorligi 1-95 ga teng bo'lsa, unda hisoblash formasi 1,95- ー CT ni tuzatish mumkin.
Hozircha flumesan miqdorik PRCR haqida tarkibiy tarkib yakunlandi.
Yuborilgan vaqt: 2023 yil 06 aprel
