Escherichia coli O157:H7 Nuklein kislotani aniqlash to'plami (PCR floresan prob usuli)
To'plam tavsifi:
Cat.No.FP102
Oziq-ovqat, ozuqa, suv namunalari va atrof-muhit namunalarida E. coli O157: H7 ni tezkor aniqlash va skrining qilish uchun ishlatiladi.
Tavsiflar
U oziq-ovqat, ozuqa, suv va atrof-muhit namunalarida E. coli O157: H7 ni tezkor aniqlash va skrining qilish uchun ishlatiladi.
[Sinov printsipi]Floresan PCR texnologiyasi printsipiga ko'ra, maxsus primerlar va Taqman zondlari Escherichia coli O157: H7 ning o'ziga xos geni uchun mo'ljallangan va lyuminestsent PCR asbobi bilan aniqlanadi, shuning uchun Escherichia coli O157: H7 DNKni sifatli aniqlash.
To'plam tarkibi
Eslatma: ROX kanal probi kiritilmagan.
| Cmuxoliflar | Spetsifikatsiya | Qbirlik |
| Bufer A | Quvur | 1 |
| Bufer B | Quvur | 1 |
| Ijobiy nazorat | Quvur | 1 |
| Salbiy nazorat | Quvur | 1 |
Kutilayotgan foydalanish
uchun ishlatiladi oziq-ovqat, ozuqa, suv namunalari va atrof-muhit namunalarida E. coli O157: H7 ni tezkor aniqlash va skrining.
Saqlash shartlari va yaroqlilik muddati
Qorong'i joyda -20 ° C haroratda saqlang va qayta-qayta muzlatish va eritishdan saqlaning.
Amal qilish muddati - 12oylar va ishlab chiqarish sanasi tashqi o'rashda ko'rsatilgan.
Asboblar va sarf materiallari
Floresan miqdoriy PCR asbobi, pipetka tabancasi va mos keladigan uchlari, vorteks chayqatish moslamasi, mini sentrifuga.
Foydalanish
1. Namunalarni qayta ishlash
1.1 Namuna turi: Ushbu to'plam oziq-ovqat, ozuqa, suv namunalari va Escherichia coli O157: H7 bilan ifloslangan deb gumon qilingan boshqa namunalar uchun javob beradi.Chuqur qayta ishlangan go'sht mahsulotlari, ichimliklar va pigmentlarni o'z ichiga olgan boshqa moddalar uchun floresan signal to'plamiga ta'sir qilmaslik uchun ularni yuvish kerak.
1.2 Namunani qayta ishlash: Namuna tayyorlash, boyitish madaniyati va ichak tayoqchasi O157: H7 izolyatsiyasi uchun "GB 4789.10-2016 Oziq-ovqat xavfsizligi milliy standarti oziq-ovqat mahsulotlarining Escherichia coli O157 mikrobiologik ekspertizasi: H7 testi" ga qarang.
- Nuklein kislotasi ekstraktsiyasi
1,5 ml santrifüj naychasiga 20 ml boyitish eritmasini oling, 200 mL mikrobial lizat qo'shing (qo'shimcha to'plam talab qilinadi), 30 soniya davomida vorteks qiling, qisqa vaqt davomida santrifüj qiling va chetga qo'ying.
Izohlar: Lizatdan nuklein kislotani olish 10 daqiqa ichida yakunlanishi kerak va uni uzoq vaqt davomida saqlab bo'lmaydi.
3. Nuklein kislotalarni kuchaytirish
3.1 Foydalanish uchun lyuminestsent miqdoriy PCR asbobini yoqing.
To'plamdagi bufer A va B buferini yaxshilab eritib oling va qisqa vaqt davomida santrifüj qiling.Har bir PCR reaksiya naychasiga 18 mkl A buferi va 2 mkl B bufer qo'shing.Keyin 5 ml dan salbiy nazorat, ekstraksiya qilingan nuklein kislota va musbat nazoratni PCR reaksiya trubkalariga qo'shing, naychalarni yoping va qisqa vaqt davomida santrifüj qiling.
3.3 PCR reaksiya trubkasini lyuminestsent PCR mashinasiga o'tkazing va kuchaytirish tajribalarini bajarish uchun quyidagi tartiblardan foydalaning: reaksiya tizimi uchun 25 ml ni tanlang, har bir sikl uchun 60°C da floresans signallarini to'plang va aniqlash kanali uchun FAM ni tanlang.
| Qadam | Dastur | Tsikllar soni |
| 1 | 37℃ 5 daqiqa | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3 min | 1 |
| 3 | 95°C 15s | 4 0 |
| 60 ℃ 30 s (floresan to'plash) |
Muammolarni tahlil qilish uchun qo'llanmalar
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
Hech qanday RNK ajratib bo'lmaydi yoki nuklein kislotaning unumi past bo'ladi
Odatda qayta tiklash samaradorligiga ta'sir qiluvchi ko'plab omillar mavjud, masalan: namunadagi RNK tarkibi, ishlash usuli, elutsiya hajmi va boshqalar.
Umumiy sabablarni tahlil qilish:
1.Muzli hammom yoki ish paytida past haroratli (4 ° C) santrifüj.
Taklif: Xona haroratida (15-25 ° C) ishlash, hech qachon muzli hammom va past haroratli santrifüj.
2. Namunani noto'g'ri saqlash yoki namunani juda uzoq vaqt saqlash.
Taklif: Namunalarni -80 ° C da saqlang yoki suyuq azotda muzlatib qo'ying va qayta-qayta muzlatish-eritishdan saqlaning;RNK ekstraktsiyasi uchun yangi to'plangan namunalardan foydalanishga harakat qiling.
3. Namuna lizisining yetarli emasligi
Tavsiya: Iltimos, namuna va ishchi eritma (chiziqli akrilamid) yaxshilab aralashtirilganligiga va xona haroratida (15-25 ° C) 10 daqiqa davomida inkubatsiya qilinganligiga ishonch hosil qiling.
4.Eluent noto'g'ri qo'shilgan
Tavsiya: RNase-Free ddH2O tozalash ustuni membranasining o'rtasiga qo'shilganligiga ishonch hosil qiling.
5. viRW2 tamponidagi suvsiz etanolning noto'g'ri hajmi
Taklif: Iltimos, ko'rsatmalarga rioya qiling, to'plamni ishlatishdan oldin viRW2 tamponiga suvsiz etanolning to'g'ri hajmini qo'shing va yaxshilab aralashtiring.
6.Noto'g'ri namunadan foydalanish.
Taklif: 500 mkl Bufer viRL uchun 200 µl namuna.Haddan tashqari namuna hajmi RNK ekstraktsiya tezligining pasayishiga olib keladi.
7.Noto'g'ri elyusiya hajmi yoki to'liq bo'lmagan elyusiya.
Taklif: tozalash ustunining eluent hajmi 30-50 mkl;agar elüsyon effekti qoniqarli bo'lmasa, oldindan qizdirilgan RNase-Free ddH qo'shish tavsiya etiladi.2O va xona haroratida joylashtirish vaqtini uzaytiring, masalan, 5-10 min
8.Purifikatsiya ustunida viRW2 tamponida yuvilgandan keyin etanol qoldig'i bor.
Taklif: Agar viRW2 tamponida yuvilgandan va 2 daqiqa davomida bo'sh trubkada santrifüjlangandan keyin ham etanol qolsa, qolgan etanolni to'liq olib tashlash uchun tozalash ustuni bo'sh trubkada santrifüj qilinganidan keyin xona haroratida 5 daqiqa davomida qoldirilishi mumkin.
Tozalangan RNK molekulalarining parchalanishi
Tozalangan RNKning sifati namunani saqlash, RNase ifloslanishi va ishlash kabi omillarga bog'liq.
Umumiy sabablarni tahlil qilish:
1.Yig'ilgan namunalar o'z vaqtida saqlanmagan.
Taklif: Agar namuna yig'ilgandan keyin o'z vaqtida ishlatilmasa, uni darhol -80 ℃ yoki suyuq azotda saqlang.RNK molekulalarini olish uchun iloji boricha yangi to'plangan namunalardan foydalanishga harakat qiling.
2.To'plangan namunalar qayta-qayta muzlab, eritildi.
Taklif: Namuna olish va saqlash vaqtida qayta-qayta muzlatish va eritishdan (bir martadan ko'p bo'lmagan) saqlaning, aks holda nuklein kislotaning unumi kamayadi.
3.RNase operatsiya xonasida kiritilgan yoki bir martalik qo'lqoplar, niqoblar va boshqalar kiymagan.
Taklif: RNK molekulalarining eksperimenti alohida RNK operatsiya xonasida eng yaxshi tarzda amalga oshiriladi va tajriba stoli tajribadan oldin tozalanadi.Tajriba davomida RNazning kiritilishi natijasida RNK degradatsiyasini oldini olish uchun bir martalik qo'lqop va niqob kiying.
4.Reagent foydalanish paytida RNase bilan ifloslangan.
Taklif: Tegishli tajribalar uchun yangi Virusli RNK izolyatsiyasi to'plami bilan almashtiring.
5.Sentrifuga naychalari, pipetka uchlari va boshqalarning RNase bilan ifloslanishi. Taklif: Santrifuga naychalari, pipetka uchlari va pipetkalarning barchasi RNasesiz ekanligiga ishonch hosil qiling.
Tozalangan RNK molekulalari quyi oqimdagi tajribalarga ta'sir qildi
Tozalash ustuni tomonidan tozalangan RNK molekulalari, agar juda ko'p tuz ionlari yoki oqsillar mavjud bo'lsa, quyi oqim tajribalariga ta'sir qiladi, masalan: teskari transkripsiya, Northern Blot va boshqalar.
1.Elutsiya qilingan RNK molekulalarida qolgan tuz ionlari mavjud.
Tavsiya: viRW2 tamponiga suvsiz etanolning to'g'ri hajmi qo'shilganligiga ishonch hosil qiling va tozalash ustunini ishlatish yo'riqnomasida ko'rsatilgan to'g'ri santrifüj tezligiga ko'ra ikki marta yuving; Agar tuz ionlari qolgan bo'lsa, tozalash ustuniga viRW2 tamponini qo'shib, xona haroratida 5 daqiqaga qoldiring.Keyin tuz ionlari ifloslanishini eng katta darajada olib tashlash uchun santrifüj qiling
2.Elutsiya qilingan RNK molekulalarida etanol qolgan
Taklif: tozalash ustunlari bufer viRW2 bilan yuvilganligini tasdiqlaganingizdan so'ng, foydalanish yo'riqnomasida ko'rsatilgan markazdan qochma tezligiga muvofiq bo'sh trubkalarda santrifüj qiling.Agar hali ham etanol qolgan bo'lsa, qolgan etanolni maksimal darajada olib tashlash uchun bo'sh trubkada santrifüj qilingandan so'ng uni xona haroratida 5 daqiqaga qoldirish mumkin.
Yo'riqnomalar:
Virusli RNK izolyatsiyasi to'plami bo'yicha qo'llanma
